云南大理野鼠畢氏腸微孢子蟲分子流行病學調查

莊爾俊 ， 王琪琪,2 ， 趙俊杰 ， 岳鳳嬌 ， 李海龍,3

(1.大理大學基礎醫學院 ， 云南 大理 671000 ； 2.山西醫科大學晉祠學院 ， 山西 太原 030000 ； 3.云南省自然疫源性疾病防控技術重點實驗室 ， 云南 大理 671000)

微孢子蟲(Microsporidia)是一種專性胞內寄生的人獸共患寄生蟲，呈世界性分布[1]。其中畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbiebeusi，E.biebeusi)是最常見的微孢子蟲，感染的宿主種類多，包括人、家畜及野生動物，通常導致腹瀉、腹痛等癥狀，對免疫功能障礙者則會導致慢性腹瀉[2-3]。近年來，國內外對人及動物的微孢子蟲流行病學調查和基因型鑒定日益增多，在我國已見于黑龍江、西藏、廣東、陜西等地的人、豬、牛以及野生動物感染[3-7]。野鼠是人獸共患病重要的傳播媒介之一，因其生存于人類生活區且活動范圍較大，易污染食物及水源，增加人類及其他動物的感染風險。關于大理地區野鼠畢氏腸微孢子蟲的相關研究尚未見報道，本試驗以大理地區的野鼠為調查對象，進行畢氏腸微孢子蟲的分子流行病學研究，旨在為當地畢氏腸微孢子蟲的防控和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 于2016年4月—2017年7月在大理地區居民區放置捕鼠籠，記錄所捕獲野鼠鼠種、體長等基本信息。共采集到新鮮糞便樣本287份，其中褐家鼠樣本270份，黃胸鼠樣本17份。畢氏腸微孢子蟲陽性DNA樣本由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。

1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，購自甘肅眾慶生物科技有限公司；MgCl2、dNTPs Mixture、10×PCR Buffer、DNA marker DL500、TaqDNA聚合酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司；Loading Buffer，購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取與引物設計 根據糞便DNA提取試劑盒說明書提取野鼠糞便樣本DNA，-20 ℃凍存備用。擴增畢氏腸微孢子蟲SSU rRNA基因中的內轉錄間隔區(ITS)，引物序列及擴增方法參考Zhang等[8]發表的研究報道。

1.3.2 產物檢測及測序結果分析 將結果中與目的條帶大小相近的產物送至金斯瑞生物科技(南京)有限公司進行測序。結果在NCBI上的GenBank中進行同源性比對，根據同源性是否100%確定其基因型或新基因型。用Clustal X 1.83進行序列比對，然后用MEGA 6.0進行進化分析并構建進化樹。

1.3.3 統計學分析 應用統計學軟件SPSS 19.0對數據進行分析，計算感染率和P值，P<0.05則差異顯著。

2 結果

2.1 巢式PCR擴增 基于ITS基因的巢式PCR檢測，287份鼠糞便樣品中，共有12份擴增出大小約為390 bp的條帶(圖1)。

圖1 野鼠糞便樣本畢氏腸微孢子蟲PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of E.bieneusi in faecal samples from wild ratsM: DNA marker DL500； 1～8:陽性樣品； 9～12:陰性樣本；13：陽性對照； 14：陰性對照M：DNA marker DL500； 1-8：Positive samples； 9-12：Negative samples； 13：Positive control； 14：Negative control

2.2 畢氏腸微孢子蟲基因型鑒定 對本試驗獲得的12個陽性樣品的測序結果分析，鑒定出3種基因型，上傳至GenBank，序列號為MG999509～MG999511。根據其序列進行種系發育比對,其中包括:EbpC(n=3)和D(n=2)基因型；1種新基因型，命名為YNM1(n=7)。在這3種基因型中，共觀察到5個多態位點(表1)，分別為序列號150、170、174、198、201。通過構建系譜樹(圖2)，本試驗的基因型EbpC、D、YNM1均屬于人獸共患病組(Group1)，基因型D和YNM1屬于Group 1a，基因型EbpC屬于Group 1d。

圖2 畢氏腸微孢子蟲進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of E.bieneusi○: 已知基因型; ●: 新基因型○: Known genotypes; ●: New genotypes

表1 大理野鼠畢氏腸微孢子蟲基因型多態位點Table 1 Genotype polymorphic sites of E.bieneusi in wild rats from Dali

2.3 野鼠畢氏腸微孢子蟲感染情況統計 287份鼠糞便樣品包括黃胸鼠(n=17)和褐家鼠(n=270)兩種，感染率分別為4.44%和0，總感染率為4.18%。根據Yan等[9]研究，分為幼年組(體長≤110 mm)、亞成年組(體長110～150 mm)和成年組(體長151～175 mm)。鼠陽性樣本中，有8只為雌性(4.57%)，4只為雄性(3.57%)；幼年組有2只為感染陽性(12.50%)，亞成年組有1只被感染(1.37%)，成年組有9只被感染(4.55%)。性別和年齡組感染率差異不顯著(P>0.05)。結果見表2。

表2 不同性別及年齡組畢氏腸微孢子蟲感染情況Table 2 The infection of E.bieneusi in different gender and age group

3 討論

通過調查大理野鼠畢氏腸微孢子蟲的感染情況，結果顯示，其感染陽性率為4.18%(12/287)，其中黃胸鼠、褐家鼠感染率分別為0(0/17)和4.44%(12/270)。在流行相關因素中，性別和年齡組差異不顯著(P>0.05)。鼠為嚙齒類動物，且種類繁多，國內有關于畢氏腸微孢子蟲感染嚙齒類動物的報道。本試驗捕獲的野鼠分為黃胸鼠和褐家鼠，目前國內尚無黃胸鼠感染畢氏腸微孢子蟲的相關報道，Zhao等[10]在黑龍江首次檢測出褐家鼠中有畢氏腸微孢子蟲感染，感染率為7.9%(19/242)。本試驗結果與Zhao等[10]的結果和Wang等[11]發現的畢氏腸微孢子蟲感染竹鼠的感染率(5.1%)相近。在Gui等[12]的研究中發現，國內青毛鼠和小泡巨鼠感染畢氏腸微孢子蟲的陽性率分別為31.6%(37/117)和35.1%(39/111)，高于本次調查的感染率。國外的報道中，黑線姬鼠感染畢氏腸微孢子蟲的感染率為42.9%(79/184)，黃頸鼠的感染率為30.0%(18/60)[13]，均高于本次調查。在不同的調查中，鼠被畢氏腸微孢子蟲感染可能與嚙齒動物的種類、研究地點及其地理條件、收集樣品的總數、檢測方法等因素有關。

通過分析野鼠的畢氏腸微孢子蟲ITS核苷酸序列，鑒定出3種基因型：EbpC(3/12，25%)、D(2/12，17%)、YNM1(7/12，58%)，在這12份陽性樣本中，YNM1鑒定出有7份是本試驗鑒定出的新型，考慮是大理地區褐家鼠感染畢氏腸微孢子蟲的優勢基因型。而在國內黑龍江地區褐家鼠的報道中，鑒定出基因型D和Peru6[10]，在海南地區的鼠類動物中鑒定出的畢氏腸微孢子蟲基因型多達16種，主要為基因型D(44.2%)[14]。在國外的研究中，也有鼠感染畢氏腸微孢子蟲基因型D的報道[13,15]。Matos等[16]的研究表明，基因型D已在40多個國家和地區被發現，是造成多數人感染的原因，同時也從多種動物和廢水中檢測出[17-20]，故更應關注水源傳播和安全用水?；蛐虴bpC不僅感染人，也出現在許多動物中[21-22]。

畢氏腸微孢子蟲基因型的分布可能與地理位置和條件有一定的關系，大理地區野鼠畢氏腸微孢子蟲的基因型具有一定的多樣性，存在較高人獸共患的風險。本試驗結果豐富了大理地區畢氏腸微孢子蟲分子流行病學數據，為該病的防控和研究提供了參考數據。