板栗果皮色素的成分鑒定及提取

劉義慶，謝 榮，胡思前，2*

（1.江漢大學化學與環境工程學院，湖北武漢 430056；2.湖北省健康代糖產品企校聯合創新中心，湖北武漢 430056）

板栗是殼斗科栗屬植物，分布于世界各地。板栗營養物質豐富，含有淀粉、多糖、蛋白質、脂肪、多種維生素和微量元素，特別是維生素C（VC）、維生素B1（VB1）和胡蘿卜素的含量比一般干果要高[1]。板栗果實有較高的醫療保健價值，中醫認為，板栗有養胃、健脾、補腎、壯腰、強筋、活血、止血、散瘀、消腫等功效，特別是對老年人有很好的滋補效能。板栗對高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等也具有較好的防治作用，故有“干果之王”的美譽，在國外被稱為“人參果”[2-3]。我國是世界板栗第一生產大國，板栗產量居世界第一。2019 年世界板栗產量2.40×106t，我國板栗總產量2.20×106t，約占世界板栗產量的90%[4]。湖北羅田板栗為湖北優質板栗品種，栗殼、板栗果皮為板栗副產品，多廢棄不用。近年來對板栗殼的綜合利用已引起人們的關注，板栗殼提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗腫瘤等生理活性，還可應用在凈化水質、食用菌生產、食品生產、印染工業等方面[5-8]。

國內學者對板栗果皮的成分與綜合利用進行了探索，如劉治梅[9]、張捷莉等[10]分別以碳酸鈉溶液和50%乙醇為溶劑提取板栗果皮棕色素，初步試驗了棕色素的性質。臧延青等[11]、陳龍等[12]分別以河南信陽和山東沂蒙板栗果皮為原料，以乙醇與水混合為提取溶劑，采用正交實驗法優化了板栗果皮色素的提取工藝。盧川等[13]發現板栗果皮乙醇提取物含有黃酮類、多酚類、甾類、脂肪酸等化學成分。綦菁華等[14]發現板栗果皮中酚類組分具有抗氧化活性。夏姣云等[15]則將板栗果皮應用于對水溶液中鎘離子和鉛離子的吸附。目前還沒有以丙酮與水混合作為提取劑提取板栗果皮中有效成分的報道。

鑒于此，本文以湖北羅田板栗作為原料，對板栗果皮的提取溶劑進行了系統研究，應用化學分析的方法確定了提取物的主要化學成分，并采用正交試驗法對板栗果皮中縮合鞣質的提取工藝進行了優化，為進一步開發利用板栗果皮奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮板栗，購自湖北羅田，去殼、剝皮并將板栗果皮粉碎，置于5 ℃冰箱中冷藏備用。

丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、溴、明膠、氯化高鐵、生物堿、鎢酸鈉、磷鉬酸、無水碳酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，分析純。沒食子酸標準品（≥99.5%，CAS：149-91-7），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

福林酚試劑的配制：鎢酸鈉50 g，磷鉬酸10 g 溶于含375 mL 水的燒瓶中，再加入25 mL、85%磷酸，水浴回流2 h，冷卻后在500 mL 容量瓶中定容并保存。

1.2 儀器與設備

721 分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；85-1恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；ST-02A 多功能粉碎機，永鑫市帥通工具有限公司；RE-S2 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 板栗果皮中色素提取及其化學成分的鑒定

準確稱取1.000 0 g 板栗果皮粉末于帶塞錐形瓶中，加入20 mL、50%丙酮-水溶液，密封，浸提3 h。過濾，減壓蒸餾濃縮，得板栗色素提取液。

取適量提取液，加入等體積乙酸乙酯進行萃取。各取四份乙酸乙酯萃取液和經過乙酸乙酯萃取后的水相部分溶液，分別做三氯化鐵顯色反應、溴水反應、明膠氯化鈉反應和生物堿反應試驗，以確定色素的物質類別。

1.3.2 沒食子酸標準曲線的繪制

采用福林酚法：取0.500 0 g 沒食子酸標準品溶于5 mL 乙醇，用水定容至100 mL。分別準確移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 上述溶液于10 mL 比色管中，蒸餾水定容，制成沒食子酸標準品溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。分別準確移取標準品溶液1.0 mL 加入10 mL 比色管中，再加入6 mL 蒸餾水進行混合后，再加入0.5 mL 的福林酚試劑，混勻后靜置5 min 后，加入1.5 mL、20%Na2CO3溶液，混合后定容至10 mL，20 ℃避光放置2 h 后，用蒸餾水作空白對照，在760 nm 下測定其吸光值A。以沒食子酸的濃度為X 軸，吸光值為Y 軸，繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.3.3 板栗皮縮合鞣質的提取率

（1）板栗果皮中縮合鞣質的總量測定

稱取板栗果皮粉末樣品0.500 0 g，置于25 mL 帶塞比色管中，加入15 mL 提取溶劑，靜置提取3 h，重復提取4～5 次至縮合鞣質提取完全，合并提取液，定容至100.0 mL，取適量提取液于10 mL 比色管中，按1.3.2 方法測定10 mL 比色管中縮合鞣質的濃度，并計算0.500 0 g 板栗果皮提取液含縮合鞣質的總量。計算公式見式（1）。

式中，m0-縮合鞣質總量，mg；c0-沒食子酸的濃度，mg/mL；V0-定容的體積，mL；n0-稀釋倍數。

（2）提取率的計算

按1.4 及1.5 設計的方法提取縮合鞣質，按1.3.2 定量方法測定縮合鞣質濃度和提取量，按公式（2）計算提取率。

式中，y-提取率；m-提取液縮合鞣質的質量，mg；c-提取液中的濃度，mg/mL；V-定容的體積，mL；n-稀釋倍數。

1.4 單因素試驗

取25 mL 比色管，各加0.5 g 板栗果皮粉末，每組3份，加入溶劑提取板栗果皮色素，分別試驗不同溶劑、混合溶劑的體積百分比濃度、提取溫度、提取時間、料液比、提取次數對板栗果皮色素提取效率的影響。溶劑考察甲醇、乙醇、丙酮；丙酮-水混合溶劑考察的丙酮體積百分比濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%。板栗果皮色素穩定性試驗顯示，板栗果皮色素在60 ℃以下穩定[10]，故提取溫度分別考察20、30、40、50、60 ℃。提時間分別考察15、30、45、60、75 min，料液比分別考察1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）。取2 mL 提取液于10 mL 比色管中，加入福林酚法顯色劑和碳酸鈉溶液，定容后靜置，測760 nm 下的吸光值，計算縮合鞣質提取率，分析各因素對縮合鞣質提取效率的影響。

1.5 正交試驗

綜合考慮提取溶劑的體積百分比濃度、料液比、提取溫度、提取時間這幾個因素對板栗果皮縮合鞣質提取率的影響，每個因素選取3 個水平進行正交試驗，從而探索板栗果皮中提取縮合鞣質的最佳條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction orthogonal test

1.6 數據處理

數據采用Excel 2010 處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 板栗果皮色素的化學成分鑒定

試驗了板栗果皮色素提取液的三氯化鐵顯色反應、溴水反應、明膠氯化鈉反應和生物堿反應試驗，實驗結果如表2 所示。

表2 板栗果皮色素的化學鑒定結果Table 2 Chemical identification results of chestnut peel pigment

表2 顯示，有機相乙酸乙酯萃取部分和水相部分均能使三氯化鐵變成灰綠色或黑色，說明板栗果皮色素提取液含有鄰二酚羥基化合物，而且能使溴水變色，能與明膠氯化鈉反應產生沉淀，能沉淀生物堿，因此判斷該提取物中含有縮合鞣質。鞣質有低縮合鞣質和多聚縮合鞣質之分，低縮合鞣質存在于乙酸乙酯中，多聚縮合鞣質存在于水中[16]。

2.2 沒食子酸標準曲線

以沒食子酸標準品配制系列濃度標準溶液，采用福林酚法測定溶液吸光度值，得回歸方程式為y=1.141x-0.006，R2=0.999 0。

2.3 單因素試驗

2.3.1 不同溶劑對板栗果皮縮合鞣質提取效率的影響

在同樣的實驗條件下研究了3 種提取劑對板栗果皮中縮合鞣質提取效率的影響，實驗結果顯示，甲醇、乙醇、丙酮三種提取劑的提取效率分別為31.3%、35.3%、41.2%。由此可見，丙酮浸提果皮色素提取效果最好，乙醇次之，甲醇最差。因此，選擇丙酮作為提取溶劑。

2.3.2 溶劑濃度對板栗果皮縮合鞣質提取效率的影響

選用不同濃度的丙酮為溶劑提取板栗果皮縮合鞣質類色素，實驗結果如圖1（見下頁）所示。

圖1 溶劑濃度對板栗果皮鞣質提取效率的影響Fig.1 Effect of solvent concentration on extraction efficiency of tannins

由圖1 可看出，隨著溶劑丙酮濃度的增加，縮合鞣質的提取量先增大后減小，丙酮的最佳濃度為40%～60%。進一步實驗比較丙酮濃度為40%、50%和60%時的提取率，發現40%、50%丙酮的提取率接近，所以選擇40%丙酮為最佳的提取溶劑。

2.3.3 溫度對板栗果皮縮合鞣質提取效果的影響

前期試驗得出，30 ℃以下板栗果皮縮合鞣質的提取效率不高，由圖2 知，30～40 ℃間隨溫度升高提取效率不斷增加，40～60 ℃縮合鞣質的提取率穩定，以40 ℃時為最好。故從提取率和節約資源兩方面考慮，40 ℃為提取板栗果皮中縮合鞣質的最佳溫度。

圖2 溫度對板栗果皮縮合鞣質提取效果的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction efficiency of tannins

2.3.4 提取時間對板栗果皮縮合鞣質提取效果的影響

由圖3 可看出，在15～60 min 范圍內，提取時間越長，縮合鞣質提取率越高，但當提取時間達到60 min 時，縮合鞣質提取率達到最大且基本不變，因此，以60 min為最佳提取時間。

圖3 提取時間對板栗果皮鞣質浸提效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of tannins

2.3.5 料液比對板栗果皮縮合鞣質提取效果的影響

由圖4 可看出，隨著提取液量的增加，提取鞣質的提取率先升高后趨于平穩，當料液比為1∶15 時，提取率最高，此時板栗果皮中的縮合鞣質已經基本提取完全，此時再增加提取液的量，縮合鞣質提取率不會繼續增加，因此，提取板栗果皮縮合鞣質的最佳料液比為1∶15。

圖4 料液比對板栗果皮鞣質浸提效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of tannins

2.4 正交試驗

由正交試驗表4 可知，四因素影響大小順序為C＞A≈D＞B，因此，提取時間對板栗縮合鞣質提取效率的影響最大，其次是丙酮濃度和料液比，它們對縮合鞣質提取效率的影響接近，料液比的影響稍低于丙酮濃度的，提取溫度對提取效率的影響最小，極差分析最佳組合為A1B2C2D2。即丙酮濃度為40%，料液比為1∶20，提取溫度為40 ℃，提取時間為60 min。

2.7 驗證試驗

為了進一步驗證試驗結果的準確性，用分析天平稱取1.0 g 板栗粉末于25 mL 比色管中，分別加入20 mL 的體積分數為40%的丙酮，40 ℃水浴加熱提取60 min，取適量于10 mL 比色管中，測得提取率為63.5%，均高于正交試驗其他組。

3 結論

我國是世界板栗第一生產大國，湖北省是國家重要的板栗出產地，羅田板栗為湖北優質板栗品種。板栗營養物質豐富，有較高的醫療保健價值。板栗果皮為板栗副產品，多廢棄不用。本實驗對板栗果皮成分進行化學分析，采用正交實驗優化板栗果皮提取工藝，為進一步開發利用板栗果皮奠定了堅實的基礎，對提高板栗綜合利用價值具有重大意義。

以體積分數為40%的丙酮為溶劑提取的板栗果皮色素經三氯化鐵反應、溴水反應、明膠氯化鈉反應、生物堿反應等一系列定性實驗證明為縮合鞣質，經乙酸乙酯萃取后，有機相為低聚縮合鞣質，水相為多聚縮合鞣質。經單因素及正交試驗發現，體積分數為40%的丙酮是提取板栗果皮縮合鞣質的最佳溶劑，最佳提取工藝為提取劑丙酮的體積分數40%，料液比1∶20，提取溫度40 ℃，提取時間為60 min，提取率可達63.5%。