中國兒童全血C反應蛋白檢測系統性能評價標準建立專家共識

中國婦幼保健協會臨床診斷與實驗醫學分會

C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是由肝臟合成的急性時相反應蛋白，因其血液濃度受血壓、心率、呼吸、血紅蛋白等其他指標的影響較小[1-2]，在感染性疾病的診斷中應用價值較大，有助于不明病因急性發熱的診斷和鑒別診斷。CRP與白細胞（white blood cell，WBC）計數聯合檢測，彌補了單純進行常規血細胞檢測的不足，已被臨床普遍接受。除公認的血清CRP檢測外，全血CRP檢測在各級醫療機構，尤其是婦幼保健機構、兒童醫院已普遍開展，但目前尚無全血CRP檢測系統的性能評價方案和標準。因此，迫切需要建立全血CRP檢測系統性能評價方法，以明確全血CRP檢測系統的性能是否能夠滿足臨床需求。本研究聯合全國26家三級甲等婦幼保健機構和兒童醫院的研究人員，通過5種全血CRP檢測系統（深圳邁瑞公司BC-5390 CRP全自動血液分析儀、深圳國賽公司Astep PLUS特定蛋白分析儀、上海奧普公司OTTOMAN-1000全自動特定蛋白即時檢測分析儀、韓國Boditech Med公司i-CHROMA Reader免疫分析儀、芬蘭奧瑞雅公司Qrion QuikRead go C反應蛋白定量分析儀）多中心數據的支持，確認了全血CRP檢測系統性能評價方法及相關指標，并達成共識。

1 樣品選擇（sample selection）

推薦取靜脈血抗凝樣品（EDTA-K2·2H2O：1.5～2.2 mg/mL ）進行全血CRP檢測系統性能評估。樣品采集參考美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H3-A6文件[3]和第4版《全國臨床檢驗操作規程》的要求[4]。采集靜脈血確實困難時，可按照末梢血采集標準流程[5]采集末梢血。

2 空白測定（background check）

建議全血CRP檢測設備空白測定＜1 mg/L。雖然《WS/T 420—2013 臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》[6]（簡稱WS/T 420）和2019年發布的《CNAS-GL037 臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》[7]均不包含空白測定，但空白測定可了解全血CRP檢測設備的本底檢測值，進而判斷測定結果是否受到影響，因此建議對該性能進行評估。測定方法建議參考《WS/T 406—2012 臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》[8]（簡稱WS/T 406），使用無CRP的稀釋液作為空白測定樣品，連續測定3次，記錄最大值。

3 攜帶污染（carryover）

即時檢測（point-of-care testing，POCT）設備不涉及攜帶污染評估，其他全血CRP檢測設備的攜帶污染評估建議低值全血CRP樣品濃度＜10 mg/L，高值全血CRP樣品濃度＞80 mg/L，攜帶污染控制在1%以內。《YY/T 0654—2017 全自動生化分析儀》[9]將攜帶污染定義為“由測量系統將一個檢測樣品反應攜帶到另一個檢測樣品反應的分析物不連續量，由此錯誤地影響了另一個檢測樣品的表現量”，與CLSI EP07-A3[10]和WS/T 406[8]定義一致，目的是觀察高值樣品對低值樣品測定結果的影響，攜帶污染的原因可能為樣品探針攜帶污染、比色杯攜帶污染、攪拌棒攜帶污染、管路攜帶污染等。攜帶污染的評估方法有臨床結果回顧、利用高值（濃度）樣品評估等不同方式。CLSI EP10-A3[11]采用了比較復雜的實驗設計和統計方法，將每批次待測物的高、中、低3個濃度水平的樣品按照指定順序排列，共10個樣品，檢測5個批次，計算有效批次的均值。《生化分析儀攜帶污染的分析評估及處理方法專家共識》[12]提出了攜帶污染與不精密度評價的共同評價方式，通過多個批次（空白1-空白3）/（高4-空白3）比值的均值確定攜帶污染。CLSI H26-A2[13]和WS/T 406[8]的計算方法更簡易，即取1份高濃度的臨床標本，混合均勻后連續測定3次；再取1份低濃度的臨床標本，混合均勻后連續測定3次；按公式：|低1-低3|×100%/（高3-低3）計算攜帶污染，本共識建議使用該方法。

4 重復性（repeatability）

全血CRP濃度＜10 mg/L時，建議全血CRP檢測設備的變異系數（coefficient of variation，CV）＜10%；全血CRP濃度＞10 mg/L時，建議CV＜6%。重復性是指在一組重復性測量條件下的測量精密度。全血CRP重復性代表全血CRP測定結果的一致程度。要求在同一實驗室，由同一操作人員，在同一設備上，使用同批號試劑，在3 h內對全血樣品進行檢測。驗證方法參考《YY/T 1513—2017 C反應蛋白測定試劑盒》[14]中的重復性檢測方法，在線性區間范圍內，選擇2～3個不同濃度的樣品。根據臨床應用場景，以10 mg/L作為分界線，各濃度樣品均重復測定10次，計算CV。本共識對重復性的要求是根據《CNAS-CL02-A003 醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床化學檢驗領域的應用說明》[15]，并結合生物學變異導出的重復性指標和室間質量評價總誤差要求導出的重復性指標，以及多中心研究的數據確定的。

5 中間精密度（intermediate precision）

中間精密度指在一組期間精密度測量條件下的測量精密度。本共識結合多中心研究數據和CRP總誤差導出的精密度要求，建議全血CRP檢測設備中間精密度＜10%。在不同文件中，中間精密度有不同的表達方法，WS/T 420[6]中為“期間精密度”；《WS/T 492—2016 臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[16]（簡稱WS/T 492）中引用“實驗室內精密度”的概念。CLSI EP15-A2[17]制定了批內精密度和實驗室內精密度驗證方案，WS/T 492[16]與CLSI EP15-A2[17]的方案相同，要求連續測定5 d，每天1個分析批，每批2個濃度水平，每個濃度水平同一樣品重復測定3次。CLSI EP05-A3[18]制定了精密度確認方案，較EP15-A2[17]的方案略復雜，每天測定2個批次，連續測定20 d，但每批次測定次數減少為2次，同時包含了批內精密度、批間精密度、天間精密度和實驗室內精密度。

6 線性（linearity）

建議使用測量區間內高、低值CRP血清樣品進行倍比稀釋，得到不同濃度的樣品，進行線性驗證。全血CRP檢測系統的線性需滿足廠家說明書要求，其上限＞100 mg/L，系列稀釋樣品的理論值與實測值的相關系數（r）＞0.975，斜率為0.95～1.05。《WS/T 408—2012 臨床化學設備線性評價指南》[19]（簡稱WS/T 408）將線性定義為：在給定的測量范圍內，使測定結果與樣品中分析物的量直接成比例的能力。使檢測系統的最終分析結果為可接受的線性的濃度范圍為線性范圍。CLSI EP06-A[20]為國際公認的定量檢測系統線性評價的指南；WS/T 408[19]建議選用與臨床標本相似的樣品進行線性評價，將高、低濃度樣品進行倍比稀釋，得到不同濃度的線性評價樣品。為避免不同患者來源的全血樣品混合造成的溶血，不建議用高、低濃度全血樣品混合制備線性樣品。用水稀釋全血樣品會因低滲造成細胞破壞、溶解，亦不推薦。0.9%氯化鈉溶液可對全血樣品進行稀釋，且不會造成溶血，但在稀釋CRP濃度的同時，也對血細胞進行了稀釋，而臨床上在用的多數全血CRP檢測系統采用指定的血細胞比容（hematocrit，Hct）數值對全血CRP檢測結果進行換算，與臨床標本變化不定的Hct結果不一致，從而影響全血CRP的換算結果。因此，在檢測系統不具備糾正Hct功能時，不建議使用0.9%氯化鈉溶液稀釋的全血樣品進行線性驗證，驗證方法參考WS/T 420[6]。

7 樣品穩定性（sample stability）

建議使用EDTA抗凝靜脈全血樣品，參考國際血液學標準化委員會2014年發布的Guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting[21]中樣品穩定性分析方法，樣品在常溫（18～25 ℃）或冷藏（2～8 ℃）條件下保存72 h，全血CRP檢測設備的測定結果相對偏差均應＜10%。CRP作為急性時相反應蛋白，其水平會隨患者病情變化迅速波動，保存的患者臨床標本不能反映當前疾病狀態，故不推薦長時間保存。但在特殊情況下，如臨床對實驗室檢測結果有疑問，在復查CRP檢測結果時，可以使用保存的臨床標本。

8 Hct對全血CRP檢測結果的影響

如果全血CRP檢測設備有Hct自動修正功能，且實驗室經過驗證，證明全血CRP結果不受Hct影響，檢測無需考慮Hct的影響；如果全血CRP檢測設備無Hct自動修正功能，需根據Hct值對CRP結果進行手動修正，或在實驗室信息管理系統上自動調出該患者同時進行的血細胞分析的Hct值，應設置修正公式，重新對CRP結果進行計算，修正公式為：全血CRP報告值=實測值/（1-Hct）。全血CRP檢測與血清、血漿CRP檢測的不同之處在于，全血CRP樣品存在Hct的個體變異。Hct對全血CRP檢測結果的影響已逐漸引起實驗室人員的關注[22-23]。部分與血常規聯合檢測的設備可根據Hct結果實時對全血CRP檢測結果進行糾正，但大部分儀器是按Hct為40%進行血清/血漿模式與全血模式CRP結果的換算，這種方法對Hct為35%～45%的臨床標本基本可行，但對于Hct極低或極高值的臨床標本的影響不容忽視。

9 高三酰甘油（triglyceride，TG）對全血CRP檢測結果的干擾

對新采購的全血CRP檢測設備，或對CRP檢測系統進行全面性能評估時，建議進行高TG干擾驗證，以相對偏差＜10%為標準，得出可干擾CRP檢測結果的TG濃度；對于采用手動加樣的POCT設備，可結合重復性調整干擾指標標準。如果樣品中TG濃度高于可干擾CRP檢測結果的濃度，需更換采用其他方法學原理的儀器重新進行CRP檢測。高TG臨床標本較常見，TG可能通過2種途徑影響CRP檢測結果：第1種是磷脂誘導的CRP聚集導致可與抗體結合的CRP抗原含量減少[24]；第2種是脂質顆粒引起的直接光學效應[25]。不同的檢測設備、方法學原理、樣品類型對TG干擾的敏感性有差異。有文獻報道，TG濃度為34.0 mmol/L時，對CRP檢測結果無明顯干擾[26]；也有文獻指出，當TG濃度達9.0 mmol/L時，對全血CRP POCT設備的檢測結果有較大影響[27]。第4版《全國臨床檢驗操作規程》指出，TG的參考區間為 ＜1.7 mmol/L[4]，驗證方法參考CLSI EP07-A3[10]，本共識多中心的研究結果表明，高血脂樣品對目前在用的血細胞分析+全血CRP一體機和特定蛋白分析儀干擾較小，當TG濃度達到19.3 mmol/L時，與未加入TG的樣品進行對比，偏差＜10 %；當TG＜15.5 mmol/L時，與自動加樣的POCT設備檢測的樣品相對偏差均＜10%；部分手動加樣的POCT設備受重復性和干擾的雙重作用，相對偏差較大（＜30%）。

10 高膽紅素對全血CRP檢測結果的干擾

高膽紅素標本也是臨床標本中比較常見的類型，需評估此類標本對全血CRP檢測結果是否有干擾，驗證方法參考CLSI EP07-A3[10]。對新采購的全血CRP檢測設備，或對CRP檢測系統進行全面性能評價時，建議進行高膽紅素干擾驗證，建議以相對偏差＜10%為標準，得出可干擾CRP檢測結果的膽紅素濃度。采用手動加樣的POCT設備，可結合重復性調整干擾指標標準。如果樣品中膽紅素濃度高過可干擾CRP檢測結果的濃度，建議采用其他方法學原理的儀器重新進行CRP檢測。《WS/T 404.4—2018 臨床常用生化檢驗項目參考區間》[28]指出，血清總膽紅素的參考區間為＜23 μmol/L，本共識采用432 μmol/L的極高膽紅素濃度進行干擾實驗，結果表明，高膽紅素樣品對目前在用的血細胞分析+全血CRP一體機和特定蛋白分析儀干擾較小，與未加入膽紅素的樣品進行對比，偏差均＜10%；與采用自動加樣的POCT設備檢測的樣品相對偏差＜15%；與采用手動加樣的POCT設備檢測的樣品相對偏差＜20%。

11 全血CRP檢測結果與特定蛋白分析儀血清、血漿CRP檢測結果的可比性（comparison）

本研究根據全血CRP檢測設備與經驗證的特定蛋白分析儀進行對比，醫學決定水平免疫層析法相對偏差建議控制在30%以內，比濁法建議控制在20%以內，方法學及樣品種類的不同均是引起偏差較大的原因。目前，關于CRP檢測的行業標準、專家共識、參考區間、溯源性參考物質均是以血清或血漿CRP檢測結果為標準建立的，因此全血CRP的檢測結果要以血清或血漿CRP的檢測結果為標準進行比對，確保全血CRP檢測結果可以滿足臨床診療的需要。CLSI EP09-A3[29]提供了不同樣品類型進行比對的方法，臨床實驗室可以參考。

12 正確度驗證

為了確保全血CRP檢測系統的溯源性，需驗證全血CRP檢測設備的測量結果與參考物質靶值或者參考實驗室賦值的血清CRP檢測結果的一致性。正確度是無窮多次重復測量所得量值的平均值與1個參考量值間的一致程度，正確度與準確度不同，準確度指單次檢測結果與參考值的一致程度，包含系統誤差和隨機誤差，而正確度與隨機誤差無關，僅與系統誤差有關。WS/T 492[16]中的正確度驗證方案指出，可以使用具有指定值的參考物質，也可使用經參考實驗室賦值的患者樣品。本共識多中心臨床研究的數據表明，所有參與的單位和5個品牌均通過正確度驗證。

執筆：潘秋輝（上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心）；向贇（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院）；馬麗娟（首都兒科研究所附屬兒童醫院）；佘尚揚（廣西壯族自治區婦幼保健院）；莫麗亞（湖南省兒童醫院）；葉輝銘[廈門大學附屬婦女兒童醫院（廈門市婦幼保健院）]；鄭磊（南方醫科大學南方醫院）

專家組成員（按所在單位拼音首字母排序）：安徽省兒童醫院（劉海鵬）；大連市婦女兒童醫療中心（集團）（王雨新）；復旦大學附屬兒科醫院（徐錦）；廣西壯族自治區婦幼保健院（佘尚揚）；貴陽市婦幼保健院/貴陽市兒童醫院（渠巍）；杭州市兒童醫院（吳亦棟）；河北省兒童醫院（李貴霞）；河南省兒童醫院鄭州兒童醫院（楊俊梅）；湖南省兒童醫院（莫麗亞）；華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（向贇）；江西省兒童醫院（柯江維）；昆明市兒童醫院（奎莉越）；南方醫科大學南方醫院（鄭磊）；南京醫科大學附屬兒童醫院（陳紅兵）；內蒙古自治區婦幼保健院（楊治理）；山東大學齊魯兒童醫院（呂欣）；上海交通大學附屬兒童醫院（張泓）；上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院（唐振華）；上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心（潘秋輝、李懷遠）；首都兒科研究所附屬兒童醫院（馬麗娟）；四川省婦幼保健院（羅紅權）；溫州醫科大學附屬第二醫院（李向陽）；烏魯木齊兒童醫院（張文利）；西北婦女兒童醫院（賈卉）；廈門大學附屬婦女兒童醫院（廈門市婦幼保健院）（葉輝銘）；徐州市兒童醫院（田禮軍）

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

致謝感謝上海交通大學醫學院傅啟華教授對本項目啟動和執行過程中給予的大力支持；感謝上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院王劍飚教授對共識撰寫提出寶貴建議；感謝上海市臨床檢驗中心居漪教授、朱宇清教授對本共識中所涉及的技術路線及方法給予驗證，并提出修改建議。