灰葡萄孢菌與藍莓果實表皮互作的超微結構

戴啟東 李廣旭 楊華 張廣仁

摘要：為明確灰葡萄孢菌與藍莓果實互作的發生規律，為藍莓結構抗病育種及采后灰霉病的防治提供理論依據。在室溫條件下將灰葡萄孢菌株接種于藍莓果實表皮，每間隔0、8、16、24、32、40、48 h切取4 mm×4 mm大小表皮組織用于組織透明檢視及掃描電鏡（SEM）觀察。結果表明，灰葡萄孢菌孢子接種于藍莓果實8 h后，孢子開始萌發，藍莓表皮細胞壁及氣孔器結構完整;病菌接菌16 h，可見凸起的菌絲頂端侵入細胞壁;接種24 h灰葡萄孢菌孢子的侵染菌絲部分溶解，并與寄主表皮融合，侵染菌絲末端可見2個分支，并侵入藍莓果皮細胞;接種32 h，灰葡萄孢菌菌絲末端可見絨毛狀結構，并侵入藍莓果皮細胞內部;接種40 h，灰葡萄孢菌侵染菌絲進一步向果皮細胞內擴展;接種48 h，灰葡萄孢菌菌絲已大量侵入藍莓果實表皮。明確了在室溫條件下病菌初侵染的時間以及主要侵入方式：即接種16 h，病菌即可侵入藍莓果實表皮細胞，接菌40～48 h病菌即完成侵入并大量擴展、繁殖。病菌侵入方式主要以菌絲直接穿透寄主表皮為主，尚未發現病菌從氣孔器侵入的證據。

關鍵詞：灰葡萄孢菌;藍莓;掃描電鏡;超微結構;互作

中圖分類號：S436.639?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0121-04

收稿日期：2021-03-12。

基金項目：遼寧省公益研究人才培養項目（編號：2015002015）。

作者簡介：戴啟東（1981—），男，遼寧營口人，碩士，助理研究員，主要從事果樹真菌病害研究。E-mail：daiqd@126.com。

通信作者：李廣旭，博士，研究員，主要從事果樹真菌分子生物學研究。E-mail：liguangxucau@163.com。

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）是一類重要的植物病原真菌，該病菌營非專性寄生，通過合成細胞壁降解酶和分泌細胞毒素（NHST）來殺死寄主組織[1]，引起藍莓（blueberry）果實變質腐爛，使采后藍莓貨架期縮短，商品價值受到極大影響。1964年，Barker等報道，該病菌可以侵染藍莓引起灰霉病[2]。灰葡萄孢菌不僅可以在藍莓的生長期侵染花器以及幼葉，引起萼片脫落、幼果腐爛，同時也是藍莓貯藏期主要的采后病害之一[3]。目前，藍莓灰霉病防治手段主要還是通過在采收前施用化學藥劑降低病菌接種密度和防止初始侵染為主。隨著藥劑抗藥性的產生，目前使用的化學藥劑防治效果和對食品的安全性問題亟需重新評估[4]。隨著我國法規的不斷嚴格，很多藥劑的限制使用使得問題變得更加緊迫。因此，提出藍莓灰霉病防治的新方法、新思路勢在必行。Reeh等報道，利用1種蜜蜂作為生物載體攜帶粉紅粘帚霉菌（Gliocladium roseum）來防治溫室藍莓灰霉病的案例[5];Weber等采用1種新型殺菌劑氟吡菌酰胺對灰葡萄孢菌不同菌株的敏感性進行了篩選試驗[6];Droby等提出，利用外源茉莉酸甲酯誘導藍莓抗性反應來防治灰霉病菌侵染[7]。國內學者對藍莓灰霉病的研究主要集中在病原菌的致病性分化以及不同藍莓品種對灰霉病的親和性等方面[8]，而對病菌與寄主侵入過程及機制的研究較少。近年來，隨著電子顯微鏡技術在植物病原菌與寄主互作方面研究的廣泛應用，國內學者做了一些相關的研究工作。其中蘋果鏈格孢菌（Alternaria mali）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana）以及草莓白粉病菌（Sphaerotheca macularis）與相關寄主互作的研究都取得一定進展[9-11]，而灰葡萄孢菌與藍莓果實互作的研究還未見報道。病原菌與寄主侵染過程的觀察對于研究寄主植物與病原菌互作機制具有重要意義，本研究通過掃描電鏡（SEM）技術以及植物組織透明染色的方法對灰葡萄孢菌侵染藍莓果實表皮的超微結構進行了不同時間點的觀察，試圖通過對侵入過程精細結構的研究為更好了解灰葡萄孢菌與寄主的侵染機制提供必要的理論依據，現將研究結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

灰葡萄孢菌菌株由遼寧省果樹科學研究所植物保護研究室保存。用于接種的藍莓試驗果實采自遼寧省果樹科學研究所藍莓資源圃，品種為北陸（Northland），為半高叢藍莓。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰葡萄孢菌與藍莓果實表皮的互作培養 首先將保存的灰葡萄孢菌菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，光照培養箱內25 ℃活化培養20 d，待菌落布滿整個培養皿，并產生灰黑色絨毛狀孢子球時，用無菌水配制成孢子懸浮液，濃度約為 2×105 個/mL，混合均勻后孢子懸浮液中加入 2 μL/mL 表面活性劑吐溫-20混勻[12]，然后將混合液均勻噴灑于藍莓果實表面后，將果實在墊有濾紙的培養皿內室溫保濕培養。

1.2.2 藍莓表皮組織透明觀察 將接菌的藍莓果實每間隔16、24、32、40、48 h后切取4 mm×4 mm大小藍莓表皮組織，用飽和水合氯醛溶液固定（水合氯醛5.5 g，無菌水2 mL），脫色過夜。然后在95%乙醇和冰醋酸混合液中再次固定24 h，浸在飽和水合氯醛溶液中，待組織透明12 d后取出，再用10%氫氧化鉀水溶液浸泡2 d，用無菌水沖洗干凈，經稀苯胺藍的水溶液染色，經切片機（NK SYSTEM PLANT MICROTOME）切片，樣品用甘油浮載檢視顯微觀察攝影（Nikon ECLIPSE E100），并記錄觀察結果。

1.2.3 灰葡萄孢菌侵染藍莓果實表皮過程的掃描電鏡觀察 將接菌的藍莓果實每隔0、8、16、24、32、40、48 h切取4 mm×4 mm大小表皮組織，用0.1%的戊二醛溶液固定12 h，再用磷酸緩沖液（pH值7.5）漂洗3次，依次用濃度為75%、85%和95%的乙醇系列梯度脫水，脫水時間每次5 min，醋酸異戊酯置換，取出后在室溫自然干燥24 h。按不同的觀察部位，用導電膠將藍莓果皮貼于樣品臺面上。用IB-2離子度膜儀真空噴金[13]。處理后的樣品在中國農業科學院原子能研究所實驗室用HITACHI su-8010高分辨場發射掃描電鏡（10 kV加速電壓）進行觀察、測量和拍照。

2 結果與分析

2.1 灰葡萄孢菌侵染藍莓果皮的組織透明觀察

藍莓果皮經組織透明檢視發現，接菌8 h，藍莓表皮細胞壁及氣孔器結構完整（圖1-A）;病菌接菌16 h，可見凸起的菌絲頂端剛剛侵入細胞壁（圖1-B）;接菌24 h灰葡萄孢菌絲體已經在寄主細胞內擴展（圖1-C）;接菌32～40 h，病菌菌絲在表皮細胞內大量繁殖，細胞壁分解，細胞內氣孔器周圍組織受到破壞進一步消解（圖1-D、圖1-E）;在接菌48 h后，藍莓表皮細胞內可見大量病菌菌絲體繁殖，并產生圓球狀的特異結構，寄主表皮細胞大量溶解（圖1-F）。在不同時間點的觀察可以發現，寄主表皮細胞的氣孔器結構完整，都沒有被病菌侵染和侵入。

2.2 灰葡萄孢菌侵染藍莓果皮的掃描電鏡觀察

藍莓果實于室溫下接種灰葡萄孢菌，接菌0 h可見病菌孢子的附著形態（圖2-A）;接種8 h灰葡萄孢孢子由底部孢子痕處萌發出侵染菌絲（圖2-B）;接種16 h后灰葡萄孢菌侵染菌絲進一步生長（圖2-C）;接種24 h灰葡萄孢菌孢子侵染菌絲部分溶解，并與寄主表皮融合，菌絲周圍出現菌絲溶解現象同時病菌菌絲出現2個分支 （圖2-D、圖2-E、圖2-F）;接種32 h灰葡萄孢菌菌絲末端己部分侵入藍莓果皮內部，侵染菌絲末端可見絨毛狀結構（圖2-G）;接種40 h灰葡萄孢菌侵染菌絲進一步向果皮內擴展，深入藍莓果皮組織內部（圖2-H）;接種48 h灰葡萄孢菌絲已大量布滿藍莓果實表皮并深入表皮組織內部，完成對果實表皮的侵染（圖2-I）。

3 討論與結論

本研究認為，灰葡萄孢菌主要通過寄主表皮直接侵入，而非氣孔器結構侵入。這與鏈格孢菌以及白粉菌的侵入方式基本一致[8，10]，但與蘋果輪紋病菌的侵入方式明顯不同，相關研究結果表明，蘋果輪紋病菌主要通過表皮氣孔器侵入蘋果枝干部位，而從傷口和表皮縫隙侵入的很少[9]。明確病菌的主要侵入途徑對結構抗病性選育藍莓新品種具有一定的參考價值。同時機械傷口和果蒂痕處也是病菌主要侵入部位，不同藍莓品種果皮的物理特性如果皮硬度、果蒂痕大小對灰霉病菌侵入皆具有一定的影響[2]。

通過對灰葡萄孢菌與藍莓果實表皮互作的組織學透明檢視以及掃描電鏡觀察研究，明確了在室溫條件下病菌初侵染的時間及主要的侵入方式。即接種16 h病菌即可侵入藍莓果實表皮細胞，40～48 h病菌即完成侵染，并大量繁殖。病菌侵入方式主要是通過菌絲直接穿透寄主表皮為主，尚未發現病菌從氣孔器侵入的證據。

植物病原真菌對寄主的入侵能力主要取決于孢子在果實表皮的萌發能力、侵染菌絲的穿透能力以及抵御寄主免疫系統阻止真菌生長的相互作用關系。灰葡萄孢菌在環境條件不利的情況下，以菌絲、分生孢子、菌核方式潛伏侵染，并長時間保持沉默，直到寄主植物生理生化環境條件適宜時引起宿主軟腐[14]。本研究觀察到灰葡萄孢菌一種不同形式的侵入過程，即生長于寄主表面的侵染菌絲二叉分枝，菌絲與寄主表面融合，菌絲內含物附著在藍莓果實表皮上，并產生類似吸器的泡狀結構侵入寄主細胞壁，這些侵入特征未見前人報道，本研究結果對于深入了解灰葡萄孢菌與藍莓表皮的互作機制具有一定的意義。由于研究過程中時間點設置數量有限，對灰葡萄孢菌侵染藍莓果皮這一動態過程的精細觀察還有待進一步深入研究闡明。同時病菌侵入寄主細胞后，產生的病理學變化還有待進一步通過透射電鏡來研究和分析。

本研究對灰霉菌侵染藍莓果實表皮不同時間點的超微結構進行了觀察和分析，明確了病菌侵染過程中與寄主組織互作的微觀特征以及寄主細胞器的變化情況。這些研究為藍莓結構抗病性新品種的選育提供了一定的理論參考，豐富了前人在灰葡萄孢菌侵染機制方面的研究內容。藍莓灰霉病由于具有潛伏侵染時間長，發病擴展迅速的特點，必須建立早期診斷技術，做到采收前期化學防治、物理防治以及農業防治相結合的方法才能取得事半功倍的效果。

參考文獻：

[1]Colmenares A J，Aleu J，Durán-Patrón R，et al.The putative role of botrydial and related metabolites in the infection mechanism of Botrytis cinerea[J]. Journal of Chemical Ecology，2002，28（5）：997-1005.

[2]Barker W G，Hall I V，Aalders L E，et al.The Lowbush blueberry industry in Eastern Canada[J]. Economic Botany，1964，18（4）：357-365.

[3]戴啟東，李廣旭，楊 華，等. 藍莓采后病害的病原鑒定及發生規律研究[J]. 果樹學報，2016，33（10）：1299-1306.

[4]Aguileta G，Lengelle J，Chiapello H，et al.Genes under positive selection in a model plant pathogenic fungus，Botrytis[J]. Infection，Genetics and Evolution，2012，12（5）：987-996.

[5]Reeh K W，Hillier N K，Cutler G C.Potential of bumble bees as bio-vectors of Clonostachys rosea for Botrytis blight management in lowbush blueberry[J]. Journal of Pest Science，2014，87（3）：543-550.

[6]Weber R W，Entrop A P，Goertz A，et al.Status of sensitivity of northern German Botrytis populations to the new sdhi fungicide fluopyram prior to its release as a commercial fungicide[J]. Journal of Plant Diseases and Protection，2015，122（2）：81-90.

[7]Droby S，Lichter A.Post-Harvest Botrytis Infection：Etiology，Development and Management[M]//Elad Y，Williamson B，Tudzynski P，et al. Botrytis：biology，pathology and control.Switzerland：Springer，2007：349-367.

[8]嚴雪瑞，趙睿杰，周 源，等. 藍莓灰霉病菌差異性比較及藍莓品種抗病性鑒定[J]. 果樹學報，2014，31（5）：912-916.

[9]張彩霞，陳 瑩，李 壯，等. 蘋果鏈格孢菌與寄主葉片互作的超微結構研究[J]. 西北植物學報，2012，32（1）：106-110.

[10]李廣旭，高艷敏，楊 華，等. 輪紋病菌在蘋果枝干上侵入途徑的掃描電鏡觀察[J]. 果樹學報，2005，22（2）：169-171.

[11]楊 瑞，王建立，于同泉，等. 運用掃描電鏡技術觀察草莓白粉病菌[J]. 電子顯微學報，2013，32（3）：260-265.

[12]方中達.植病研究方法[M]. 3版.北京：中國農業出版社，1998.

[13]肖 媛，劉 偉，汪 艷，等. 生物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法[J]. 實驗室研究與探索，2013，32（5）：45-53，172.

[14]趙紅霞，茍 萍.灰葡萄孢菌致病機理研究進展[J]. 生物技術，2014，24（1）：100-103.