新城疫、禽流感血凝抑制試驗(yàn)解析

楊麗仙 孫艷平* 肖桂萍 周顯珍 王喬平 董昱廷

（1，云南省曲靖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 655000；2，云南省曲靖市獸藥飼料監(jiān)察所 655000）

血凝與血凝抑制試驗(yàn)(HA-HI 試驗(yàn)) 具有經(jīng)濟(jì)、快速、可靠、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品報(bào)告禽類血樣的抗體水平，是我國(guó)各地防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)和養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、疾病診斷及免疫效果監(jiān)測(cè)的主要方法之一。實(shí)踐中，HA-HI 試驗(yàn)的操作易受樣品、試劑、器材、人員、環(huán)境等因素影響，使其敏感度、準(zhǔn)確度降低，造成試驗(yàn)結(jié)果偏差，甚至誤判，只有充分理解試驗(yàn)的各方面實(shí)質(zhì)和要領(lǐng)，才能熟悉應(yīng)用好本試驗(yàn)原理。

1 原理

細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面覆蓋、吸附抗原的顆粒性物質(zhì)，與相應(yīng)抗體（免疫血清、疫病恢復(fù)期血清）結(jié)合后，在電解質(zhì)參與下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，顆粒抗原被凝集形成肉眼可見(jiàn)的團(tuán)塊，這類試驗(yàn)統(tǒng)稱為凝集試驗(yàn)，新城疫、禽流感許多病毒的包膜中含有按病毒密碼合成的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)（血凝素）有凝集某些動(dòng)物紅細(xì)胞的能力，稱為紅細(xì)胞凝集，簡(jiǎn)稱血凝(HA) 試驗(yàn)。血凝試驗(yàn)?zāi)鼙幌鄳?yīng)的特異性抗體抑制，阻斷病毒顆粒表面的抗原與紅細(xì)胞凝集，先使抗體與病毒結(jié)合，血凝素不能吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，紅細(xì)胞將進(jìn)行自然下落，沉降到V 形孔底部，這種紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)簡(jiǎn)稱血凝抑制(HI) 試驗(yàn)。

2 材料與方法

2.1 材料

微量移液器、96 孔微型血凝反應(yīng)板、微量振蕩器、加樣槽、微量移液器槍、新城疫（禽流感）標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清與待檢血清、1%雞紅細(xì)胞懸液、PBS 液。

2.2 方法步驟

2.2.1 1%雞紅細(xì)胞懸液配制

（1）為避紅細(xì)胞自凝現(xiàn)象，配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)采集3只SPF 雞或未免疫的成年公雞血液（抗凝劑與血液比例為1：4，每只雞的紅細(xì)胞分別抗凝保存）。

（2）將抗凝紅細(xì)胞加入10ml 離心管中，加入3～4 倍體積生理鹽水，以2000～3000r/min，離心5～10min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入10 倍以上血量的生理鹽水，上下緩慢顛倒或用吸管輕輕吹打數(shù)次（切忌用力過(guò)大使紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)離心、洗滌3～5 次（如果不能確保供采紅細(xì)胞公雞是否免疫過(guò)，可多洗1～2 次）直至上清液清亮透明為止。用吸管輕輕吸走上層上清液和白細(xì)胞、血小板備用。

圖1 全血離心后實(shí)物圖

（3）用生理鹽水配制1%的紅細(xì)胞工作液（為保證不取到雜質(zhì)和破壞紅細(xì)胞，吸取紅細(xì)胞時(shí)，吸取過(guò)程中吸口保持在液面下，接近離心管底處慢吸慢出）。

2.2.2 血凝試驗(yàn)（4 單位抗原的制備）

（1）用滅菌的生理鹽水按說(shuō)明稀釋、混勻新城疫、禽流感病毒。

（2）取96 孔V 形微量反應(yīng)板，加生理鹽水或PBS 作稀釋液。

（3）吸取0.025ml 新城疫（禽流感）病毒均勻懸液分別加入第1 孔，移液器吹打3～5 次充分混勻，從第一孔中吸取0.025ml 混勻后的病毒液加到第二孔，混勻后吸取0.025ml 加入第三孔，依次進(jìn)行倍比稀釋到第十一孔，從第十一孔吸取0.025ml 棄之，換吸頭。

（4）加0.025ml 稀釋液（可以理解為補(bǔ)液，使每孔的總反應(yīng)體積和后面的HI 試驗(yàn)統(tǒng)一成75ml，確保不讓肉眼和液體表面張力等因素差異而影響結(jié)果的判定）。

（5）加0.025ml 1%雞紅細(xì)胞懸液（輕緩、充分混勻紅細(xì)胞液，搖動(dòng)容器時(shí)不能用力過(guò)猛而使紅細(xì)胞破裂）振蕩混勻，室溫20～25℃下靜置40min 后觀察結(jié)果，也可4℃靜置60min，生理鹽水對(duì)照孔的紅細(xì)胞成明顯的紐扣狀沉淀到孔底時(shí)判定結(jié)果。

（6）在生理鹽水對(duì)照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，將反應(yīng)板45°角傾斜，看紅細(xì)胞的凝集程度（可從反應(yīng)板的背面觀察）。完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU），1個(gè)血凝單位稀釋倍數(shù)除以4 即為含4HAU 的抗原的稀釋倍數(shù)。

2.2.3 血凝抑制試驗(yàn)

血凝抑制試驗(yàn)方法是將受檢血清與標(biāo)定好的抗原發(fā)生充分反應(yīng)，從而達(dá)到抑制病原和紅細(xì)胞凝集。

（1）在微量反應(yīng)板中加入0.25ml 生理鹽水。

（2）分別吸取0.25ml 血清樣本、陰性、陽(yáng)性對(duì)照樣品加入各自設(shè)定排的第1 孔，依次倍比稀釋至設(shè)定的最后孔。從最后孔吸取0.025ml 棄之，換吸頭。

（3）除空白對(duì)照外，其他各孔加入4HAU 混勻的病毒抗原液0.25ml，室溫（約20℃）靜置至少30min。

（4）每孔加入0.25ml 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置40min（約20℃）。

（5）結(jié)果判定：對(duì)照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)紐扣狀完全沉淀于孔底（周邊液體透明清亮）時(shí)判定結(jié)果。

以完全抑制4 個(gè)HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI 滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2 log2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1 個(gè)滴度的試驗(yàn)結(jié)果才有效。

3 討論

3.1 本試驗(yàn)采用4 單位的抗原

一方面跟人們認(rèn)識(shí)事物的習(xí)慣有關(guān)，人們目測(cè)實(shí)物時(shí)通常會(huì)把整件物品意向地分成4 等份，同樣把血凝反應(yīng)程度分成相等的4 份：出現(xiàn)大的凝集片或小的顆粒狀物，液體完全透明，為全部凝集，記作++++；有明顯的凝塊，液體幾乎透明，也可以理解成有3/4 凝集，1/4 不凝集，記作+++；有可見(jiàn)的凝集塊，液體半透明，可以看有2/4（一半）凝集，一半的不凝集，記作++；液體渾濁，僅可見(jiàn)少數(shù)顆粒狀物，可理解成有1/4 凝集，3/4 不凝集，記作+；液體均勻渾濁，無(wú)任何凝集物，記作—。

另一方面是試驗(yàn)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)的必然，我們知道抗原與抗體或紅細(xì)胞是按一定比例結(jié)合的，當(dāng)比例合適時(shí)結(jié)合最充分，復(fù)合物最多，反應(yīng)最明顯，結(jié)果出現(xiàn)最快，我們稱之為等帶；如果比例不當(dāng)，抗原或抗體過(guò)剩時(shí)，未被結(jié)合的抗原或抗體會(huì)游離在液體中，出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，呈現(xiàn)微凝集和不凝集。實(shí)踐證明，免疫血清抗體的量是絕對(duì)充裕，充裕到從1：2～1：4096 甚至更高后恰好適合和4 倍抗原相結(jié)合。

3.2 測(cè)定抗原效價(jià)

在測(cè)定抗原效價(jià)時(shí)，如果遇到所做的幾排平行血凝試驗(yàn)出現(xiàn)在相鄰滴度之間無(wú)法確定的情況，可取中間值或中間偏前或后的1/4 值，測(cè)定情況見(jiàn)圖2，第一、二排的第9 孔剛好完全凝集，滴度為1：512；第三、四排在的8 孔剛好完全凝集，滴度為1：256。可以按兩個(gè)滴度的中間值1：384 來(lái)配抗原，4 倍血凝單位抗原所對(duì)應(yīng)的稀釋比例就為1：96。注：256+（512-256) ÷2=384，384÷4=96。

圖2 抗原效價(jià)測(cè)定情況圖

3.3 4HAU 抗原液反測(cè)

在測(cè)定抗原效價(jià)時(shí)很容易引起較大誤差，可以從反方向來(lái)測(cè)看所配制的抗原是否最接近真正意義的4 倍抗原：在稀釋板上生理鹽水0.025ml，把已經(jīng)配好的抗原工作液按倍比稀釋，后依次每孔加0.025ml 生理鹽水和1%的雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，靜置40min（約20℃），實(shí)時(shí)觀測(cè)結(jié)果，如果這時(shí)1：4（理論值應(yīng)該為1HAU）稀釋的孔剛好完全凝集，說(shuō)明我們所配抗原就是4 倍抗原；如果是1：2 稀釋的孔剛好完全凝集，所配的抗原不是4 倍而是2 倍抗原，就需要按要求加抗原原液來(lái)使其達(dá)到4 倍抗原；如果是1：8 稀釋的孔剛好完全凝集，所配的抗原不是4 倍而是8 倍抗原，那么就可以在已配抗原液中添加生理鹽水使其稀釋為4 倍抗原液。

3.4 影響試驗(yàn)的因素

3.4.1 溫度

本試驗(yàn)反應(yīng)與溫度密切相關(guān)，一定溫度可以增強(qiáng)抗原與抗體、紅細(xì)胞的結(jié)合機(jī)會(huì)，加快反應(yīng)速度，本試驗(yàn)室溫（20～25℃）或4℃溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)致反應(yīng)不充分。

3.4.2 電解質(zhì)

適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)能降低抗原抗體結(jié)合物表面的負(fù)電荷，使之失去相互排斥的能力，呈現(xiàn)沉淀或凝集，常用0.85%～0.90%的生理鹽水或pH 為7.2 的PBS 液。

3.4.3 時(shí)間

抗原、抗體要結(jié)合30min；抗原和紅細(xì)胞凝集反應(yīng)40min。如果時(shí)間不夠則反應(yīng)不充分，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、水分蒸發(fā)或凝集塊解體而紅細(xì)胞重新下沉。

3.4.4 酸堿度

本試驗(yàn)適宜的pH 為6～8，過(guò)高或過(guò)低的pH 均可使抗原抗體復(fù)合物重新離解，或紅細(xì)胞破裂。當(dāng)pH 降至3 左右可引起非特異性酸性凝集。

3.4.5 雜質(zhì)異物

無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、多糖等非特異性物質(zhì)和雜質(zhì)會(huì)抑制正常反應(yīng)，引起非特異性反應(yīng)。