中草藥脫毒技術研究進展

蔡時可，李靜宇，梅 瑜，顧 艷，徐世強，孫銘陽，王繼華

（廣東省農業科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室/廣東省道地南藥資源保護與利用工程中心，廣東 廣州 510640）

中醫藥極具中國民族特色，發展和推進中醫藥產業現代化是國家中長期發展規劃目標,其中,中草藥是產業的基礎也是我國重要的戰略資源之一［1］。近年來，隨著中醫藥事業的發展，對中藥材種植業要求也越來越高，而種業是中藥材生產的源頭［2］。然而，在中藥材種植生產實踐中，由于植物病毒和病原菌等在中藥材體內進行傳遞及積累，導致其正常生長受到抑制、甚至死亡，也是種性退化的主要原因，進而制約種植效益的提升［3］。特別是多年生無性繁殖的中草藥品種，由于生長周期較長，受到病害侵染的機率高，生產上種源缺乏嚴格檢測容易帶毒，導致其農藝性狀和藥效成分下降，影響藥農的種植收益和中醫藥產業的可持續發展。

自然界中，植物花葉病是較為常見的植物病害。該病毒可導致植物葉片萎蔫，呈黃白色斑駁，破壞葉綠體的完整性，光合作用速率降低，影響植物正常生長，甚至導致植株死亡。為解決這個問題，生產上可以利用植物脫毒技術開展健康種苗生產，對植物病毒和病菌進行有效清除。其中，以花葉病為代表的植物病毒是植物種苗脫毒的主要目標之一。病毒或病菌在莖尖等生長迅速的組織內由于繁殖速度低于植物細胞生長而含量低。利用植物激素處理離體的莖尖可獲得完整的無毒植株。1952 年Morel 利用莖尖脫毒技術在感染花葉病毒的大麗菊得到無病毒植株，建立了植物組織培養脫毒技術，并在生產上得到逐漸應用［4］。目前，依托植物組培技術的脫毒方式是主要途徑，生產上可結合物理和化學處理，更為有效清除植株體內的病毒和病菌，達到提純復壯、恢復種性、有效提高產量和品質的效果。

近年來，植物脫毒技術已在甘蔗、草莓、馬鈴薯、甘薯和香蕉等植物上得到廣泛研究及應用，有效推動種苗的標準化生產。目前在部分藥用植物如半夏、菊花、地黃和百合等逐漸開展應用。植物脫毒技術可以恢復藥用植物的種性，純化種質，緩解當前中草藥種植過程中種苗混雜的現狀，與系統選育、工廠化育苗技術相結合，可有效提升中草藥的育種水平，加速良種的應用，推進中草藥種植的標準化生產，促進中醫藥產業的持續發展。

1 中草藥脫毒方法

1.1 組織培養脫毒法

1.1.1 莖尖與珠芽培養脫毒法 自從Morel 獲得脫毒大麗菊以來，植物健康種苗得到廣泛研究與應用［3］。其原理是利用病毒在寄主植物體內不同組織和部位分布不均勻。其中，在分裂和組織生長迅速的莖尖生長點，同時也缺乏維管束系統的運輸，病毒在胞間連絲傳遞的速率比較緩慢，病毒濃度積累低。因此，在靠近頂端分生組織，病毒濃度低，通過對莖尖剝離和培養，容易脫去病毒、細菌、真菌等，獲得無病毒植株［3，5］。但莖尖大小與莖尖脫毒成活率和脫毒效果密切相關，是影響植物脫毒效率的重要因素。大體積的離體莖尖外植體容易成活，但是含有病毒的風險大，太小，則不容成活［6］。莖尖培養具有脫毒效果好、變異率低的優點，缺點是取材部位有限和操作繁瑣。莖尖脫毒技術近年來在中草藥上應用已取得一定的進展。

半夏莖尖在植物激素處理下容易形成愈傷組織，脫毒研究也相對較多，已獲得多種脫毒健康半夏種苗。王寶霞等［5］利用濃度分別為1.5、2.0 mg/L 的6-BA 和2,4-D 處理半夏莖尖，愈傷組織誘導率最高，并可一次性成苗，檢測結果表明TMV、CMV 和SMV 脫毒率均達到100%。李會等研究表明，掌葉半夏0.2～0.5 mm 的莖尖培養在MS 基礎培養上添加1.0 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 的培養基上，試管苗可以一次性誘導成功，成活率為53.3%，病毒脫除率為76.7%，而在培養基中附加247 mg/L NH4+可有效提高莖尖成活率至86.7%，移栽后成活率高達100%。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA30.5mg/L 組合最有利于試管莖的形成和發育［6］。太子參的脫毒技術也較為成熟，一般取長約0.5 mm、帶有1～2個葉原基的莖尖，以MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 為出苗最優培養基，培養40 d 出苗率可達到86.7%；而在1/2MS+1.5 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA的培養基上，生根率達到93.3%；組培苗成活率為85.2%，定植成活率為100%，經過目測法和指示植物鑒定法檢測，獲得不帶病毒組培苗，單株產量比傳統種根組培苗增產102.7%［7］。大量研究表明，離體莖尖的大小為0.2 mm 左右，在太子參脫毒率和成活率方面可以達到最優［8］。

1.1.2 愈傷組織誘導脫毒法 單個莖尖通過器官發生途徑進行增殖，擴繁效率相對較低，而植物愈傷組織途徑的增殖更為有效。利用外源植物激素誘導植物器官或組織產生愈傷組織來誘導脫毒，再分化出芽并培養成為完整植株，經病毒檢測篩選獲得無毒植株的方法，在生產中往往選擇病害較少的植物組織作為外植體，如莖尖、花藥和嫩葉等來提高脫毒效率。愈傷組織誘導脫毒技術現已在多種大田植物上獲得成功［3］。李松等利用甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術，在莖尖胚狀體分化苗增殖5 代后擴繁 2 589 倍，對甘蔗宿根矮化病病菌的去除率為95%，而花葉病病毒的去除率達到100%［9］。目前，利用愈傷組織開展脫毒中草藥種苗繁育的還不多。其中，利用2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 的激素可誘導丹參葉片產生愈傷組織，最佳分化培養基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，出芽率為90%；1/2 MS+0.5 mg/L IBA 適宜于試管苗生根，為解決丹參栽培中的資源和質量問題提供技術支撐［10］。但是，大中草藥愈傷組織的再生體系是研究的熱點，鎖陽［11］、梔子［12］、川貝母等［13］等均有完整的再生體系，本研究室近年來也已獲得了廣藿香、穿心蓮、春砂仁和千里香的再生體系，為脫毒種苗的規?；a提供了技術支撐。

1.2 物理脫毒法

高溫和低溫處理可以鈍化植物病毒的活性，而化學試劑可以抑制病毒的復制，物理和化學處理法可用于植物脫毒研究，而這些方法可與組織培養的方法結合，大大提升脫毒的效率［3］。

1.2.1 熱處理脫毒法 和植物細胞相比，病毒的耐熱能力相對較弱，在高溫脅迫下容易失去活性，同時，適當的熱處理也會加快植物的生長。因此，針對植物及病毒對溫度的敏感程度不同的特點，進行特定的溫度和時間范圍處理，使植物病毒死亡或者鈍化，或者降低病毒擴散速度，使其低于植物細胞分裂速度，容易在生長點形成無病毒區域；再利用細胞全能性，將把不含病毒的生長點進行人工培養，可以獲得無毒植株［3］。近年來結合熱處理和莖尖培養法比一些單獨使用莖尖或熱處理果樹脫毒效果好。熱處理一般采用35～55 ℃的熱水或高溫蒸汽、高溫空氣，處理時間根據溫度的高低和外植體的種類決定［3］。例如，38.5 ℃熱處理羅漢果組培苗10 d，可獲得完全脫毒的健康種苗［14］；半夏莖尖呈疊套型生長，切取完整離體莖尖比較困難，采取高溫鈍化病毒結合莖尖脫毒的方法，將半夏的試管植株先采用高溫（38 ℃，40 d）處理，然后再切取莖尖，去除病毒效果明顯，脫毒率達到88.9%，是一種行之有效的方法和手段［15］。由于外植體成活率隨熱處理時間增加而降低，研究發現變溫處理結合莖尖培養可有效提高外植體成活率和脫毒率。配合抗生素可進一步加強抑制高溫條件下病毒的活性，極大地增加獲得脫病毒植株的成功率，采取高溫結合剝離莖尖脫毒的方法，再輔以抗生素的使用，可使病毒去除成功率高達85%以上［16］。

1.2.2 超低溫處理脫毒法 超低溫處理脫毒也是一種常用的植物脫毒方法，大多與植物組織培養技術配合使用，也是利用植物細胞的特定和病毒分布特點。植物莖尖和根尖的頂端分生組織的細胞具有排列緊密、體積小、無成熟液泡、細胞分裂和再生能力強的特點，由于細胞自由水含量低，細胞質容易處于無定形狀態，在超低溫環境中也較易存活，存在病毒的可能性也較小。而生長點周圍的細胞大多為成熟的細胞，容易帶有病毒，由于液泡成熟而含有大量自由水，在超低溫環境中會形成樹枝狀冰晶，破壞細胞的膜結構，導致細胞死亡［3，17］。利用超低溫對植物細胞進行選擇性殺傷，殺傷含有病毒的成熟細胞，得到病毒含量低的頂端分生組織，容易得到脫毒植株［3，17］。超低溫脫毒方法最早由Brison 使用，結合莖尖培養脫毒方法，成功去除了李屬根狀莖上的李痘病毒，脫毒率達到50%，是單一使用莖尖剝離脫毒率 19%的2.5 倍［18］。目前常用的超低溫方法還發展出包埋干燥法、玻璃化法、小滴玻璃化法和包埋玻璃化法。低溫脫毒的流程包括：一是預處理，超低溫處理前，首先要對莖尖進行脫水和干燥，增強莖尖對超低溫的耐受能力（可使用高濃度蔗糖的使其脫水，或者利用甘露糖、甘露醇和二甲基亞砜等保護劑，也可利用無菌風干燥或玻璃化處理）；二是液氮超低溫處理（將莖尖置于液氮中），進行選擇性殺死生長點外圍細胞；三是冷凍處理的莖尖復蘇及再生；四是再生植株的繼代繁殖及相關檢測，得到無毒的健康植株。其中，低溫處理材料的狀態是脫毒成敗的關鍵因素，如外植體的大小、品種間的差異、外植體的生理狀況。因此，超低溫處理需要針對不同植物材料對脫水劑種類、脫水劑濃度、脫水時間、脫水步驟進行優化［17］。以太子參莖尖為外植體，采用超低溫去除病毒方法，優化了芽增殖誘導、叢生芽誘導、生根壯苗的適合條件，獲得了太子參規?；缂夹g。結果表明：超低溫處理1 h 后，太子參脫毒率可達90%以上；規?；M培育苗最適宜配方為初代培養基為改良MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，繼代增殖培養基為改良MS+1.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，壯苗生根培養基為改良MS+0.2 mg/L KT+1.5 mg/L AD-6+10%蛋白粉［19］。

超低溫處理、熱處理及莖尖培養技術結合的綜合脫毒方法也逐漸應用。靳慧潔等結合超低溫脫毒、莖尖培養及熱處理脫毒方法成功獲得了百合脫毒苗［20］。然而超低溫脫毒目前只應用于十幾種植物，但廣泛應用于植物材料的超低溫保存，已成功應用于約200 種植物，其應用前景非常廣闊［3，17］。超低溫脫毒處理條件比較嚴格，是限制該方法應用的主要因素。因此，篩選出相對通用的超低溫處理方法將是未來研究的重點［17］。

1.3 化學物質脫毒法

病毒抑制劑可通過不同的作用方式抑制和清除植物病毒，可用于中草藥的健康種苗生產。目前常用于組織培養的病毒抑制劑有三氮唑核苷（病毒唑）、9-（2-羥二氧）甲基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、5—二氫尿嘧啶（DHT）和雙乙酰-二氫-5=氮尿嘧啶（DA—DHT）等［3］。目前的研究表明，病毒唑的抑制效果相對較好，應用也較為廣泛。這些藥物可以直接注射到帶病毒的植株上或者添加到植株生長的培養基上用于植物病毒的清除［21］。采用莖尖培養和使用病毒抑制劑相結合的脫毒方法，對材料大小要求不嚴，則對于有些比較難脫除的病毒，采用病毒抑制劑結合熱處理和莖尖培養的方法使用，效果較好，如10 mg/L 病毒唑和熱處理（39 ℃處理15 d），對于東方百合的無癥病毒及百合斑駁病毒的脫毒率分別為55%和40%［22-23］。

在生產上中草藥的脫毒技術也逐步從莖尖培養、熱處理脫毒、冷凍脫毒、病毒抑制劑處理等單一脫毒方法，向2 種和3 種復合方法結合使用發展，逐步提高脫毒率；同時，培養條件的不斷優化也逐步提高成苗率和繁殖率，提高工廠化和商品化規模，降低生產成本，促進脫毒苗的生產應用［5，24］。

1.4 病毒檢測技術

利用病毒學檢測方法來確定植物脫毒效果，在健康種苗的生產上，植物病毒檢測方法與有效的脫毒方法都非常重要。自1990 年起，建立了大豆黃葉病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯A 病毒、甘蔗花葉病等多種植物病毒的檢測方法。病毒檢測的方法也隨著科學技術的發展不斷改進，包括目測法、指示植物法、顯微鏡檢測、核酸檢測和免疫檢測等，這些方法在脫毒苗的檢測中各有優劣。目測法是傳統上一直沿用的檢測方法，操作簡單，但是這種方法依賴植株的病癥，因此需要較長的時間，對一些未知的病毒很難檢出。指示植物法，對檢測的范圍有所增加，結果更為準確，但也存在費時，效率低的問題。近年來隨著生物科學的迅猛發展，許多先進的理化與分子檢測技術如免疫學方法，分子生物學方法等成為病毒檢測技術的常用的方法［21］。其中，依賴以核酸的病毒檢測技術主要有簡并引物PCR 技術、免疫捕捉PCR 技術、多重PCR 技術、環狀等溫擴增技術和熒光定量PCR 方法等5 種。與其他方法相比，熒光定量PCR 方法的特異性強，靈敏度高適合高通量的檢測，因而適于廣泛應用［21］。

在脫毒中草藥的檢測方面也是經歷了從直觀到微觀的過程。早期，采用田間觀察法和指示作物法檢測亳菊病毒病，其中，黃瓜、中國枸杞、千日紅等為指示植物，但大多數病毒病癥狀為花葉、黃化、畸形，易與環境脅迫或生理病害混淆，因此田間觀察法具有一定的缺陷［25］。利用SMV、CMV、TMV 單克隆抗體和RT-PCR 方法對半夏無毒苗進行病毒檢測，表明不同培養基對病毒的脫毒效果有影響。其中培養基H 對SMV、CMV 和TMV 的脫毒率達到100.0%;而培養基B所誘導的無毒苗脫毒不徹底［5］。太子參中的的主要病毒為蕪菁花葉病毒（TuMV）和蠶豆萎蔫病毒（BBWV）根據 GenBank 數據庫中的 TuMV、BBWV 外殼蛋白（CP）基因核苷酸序列的保守區域分別設計簡并引物建立的雙重 RT-PCR 快速檢測方法可穩定、準確、靈敏地同時檢測TuMV 和BBWV［26］。目前中草藥脫毒苗的應用還不多，檢測的重視程度還有待提高。

2 中草藥種傳病源

2.1 中草藥種傳病源

中草藥的病源主要有病毒、細菌和真菌，其中在百合、半夏、地黃和菊花中植物病毒的危害較為常見，如半夏病毒病、菊花病毒病、地黃病毒病等病毒病，而細菌病有廣藿香青枯病、廣藿香根瘤病等。生產上，百合由于長期采用鱗莖、鱗片等營養器官進行無性繁殖，加之，生產周期長，導致病毒積累，種球種性退化嚴重，直接影響百合的品質和產量，制約了產業的發展，在貴州銅仁、畢節等產地尤為突出［27］。目前報道的菊花病毒有10 余種，但不同的品種和種植區域病毒的種類也有差異［25］。其中，在浙江省桐鄉侵染杭白菊的病毒病原為菊花病毒［28］。半夏的病毒種類較多，且與種植地區和品種相關，病毒種類主要有紫花苜?；ㄈ~病毒、馬鈴薯病毒、大豆花葉病毒、煙草花葉病毒、番茄斑萎病毒、黃瓜花葉病毒、南芥菜花葉病毒、彈狀病毒和魔芋花葉病毒等均有報道［5，15-16］，其中在來自浙江寧波、浙江蕭山、河北、安徽、四川南充、北京和江蘇豐縣七個地區的三葉半夏中均存在黃瓜花葉病毒或大豆花葉病毒，但野生三葉半夏的帶毒率明顯低于栽培三葉半夏［29］；同時，在三葉半夏中還有檢測到軟腐病原菌［29］。太子參的病毒病同樣普遍，在福建省閩東地區侵染病毒種類有4 種：蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蠶豆萎蔫病毒和煙草花葉病毒［7］。煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蠶豆萎蔫病毒和康乃馨意大利環斑病毒等在懷地黃上均有報道［30-31］。河北傳統藥材產區的丹參易感染黃瓜花葉病毒［32］。藏紅花的主要病毒有蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、鳶尾花葉病毒、煙草脆裂病毒和菜豆黃花葉病毒［3］。

2.2 種傳病源危害現狀

植物病毒在入侵宿主后，在宿主細胞內進行自我復制和傳播，干擾新陳代謝，最后使整株植物發病，甚至導致植物死亡，植物病毒素有“植物癌癥”之稱，自然界中可侵染植物的病毒有600 余種，但缺乏病毒病的特效治療藥物，每年造成的經濟損失約600 億美元以上［5，8］，已成作物產量和質量降低的主要因素之一［33-34］。隨著中草藥的規模化人工種植，植物病毒的危害也日益嚴重。

病毒侵染人工栽培的半夏后，葉片皺縮呈斑駁、花葉、變小、沿脈變色，植株矮化及畸形等癥狀［5，15-16］。在羅漢果主產區90%以上的植株感染花葉病毒，給種植戶造成了巨大的經濟損失［35］。菊花被病毒侵染后，影響植株生長，導致植株矮小，花的直徑變小，葉片上出現斑點甚至壞死，在減產的同時還嚴重降低經濟價值［25］。長期來，太子參以種根無性繁殖，在產區往往因為連作和蚜蟲傳毒，根內的花葉病毒逐年積累，造成葉片光合作用變弱，太子參病毒病普遍發生，參根產量和質量下降嚴重［7，36］。目前，太子參花葉病病情日趨嚴重，部分地區發病率高達60%～90%,每年平均減產22%［7］。太子參懷地黃病毒導致葉片呈現花葉、褪綠、黃化及畸形等典型病毒病癥狀；地下塊根表現為不能正常膨大、籠頭變長和產量嚴重下降［30-31］。河北產區的丹參易感染黃瓜花葉病毒，產量及丹參酮含量大幅下降［32］?？糠智驘o性繁殖的藏紅花，積累病毒后使品質及產量下降［3］。對脫毒植株進行規模化生產和應用是防治植物病毒病最有效的途徑之一［19］。目前，植物病毒的剔除是利用植物脫毒技術開展中草藥健康種苗生產的熱點。但與大田農作物相比，中草藥的病害研究目前還相對落后。

3 脫毒技術在中草藥上的應用

3.1 脫毒種苗的表現

植物病毒主要是通過植物營養體的無性繁殖進行傳播，并逐漸積累，長期依賴無性繁殖的品種，由于體內病毒大量積累，致使植物發生病癥，并導致種性退化，無法滿足中藥材生產可持續發展［24］。脫毒苗在種植早期不存在病毒的侵擾，在生長、抗性上要優于傳統種苗，因此在產量、品質上有很大的提升。目前對于一些中草藥病毒病害的防治還沒有特別安全有效的方法,而半夏脫毒苗的培養成為解決中草藥病毒病最經濟、有效、安全的途徑［5］。

3.1.1 對生長的影響 脫毒苗最直觀的表現在于其形態的變化，生長速度加快，生長勢明顯提高。脫毒半夏植株葉色綠、生長健壯、整齊、抗病效果明顯，較未脫毒植株株高增加 0.7～1.7 cm，珠芽離地面高度增加0.2～0.3 cm［15］。麥冬脫毒苗分蘗快，分蘗數明顯增多，塊根數目增加［37］。脫毒懷地黃苗的株高、冠幅、葉片數、最大葉面積、功能葉片的光合色素含量、凈光合速率、蒸騰速率等各項指標均優于非脫毒苗、塊根膨大速度也明顯加快［38-39］。太子參的3 種組培脫毒種苗（即莖尖苗、愈傷組織苗、種子苗）的大田生長速度均顯著優于對照苗［36］。但是隨著種植代數的增加，植株在生長過程中受到病毒的危害，生長的優勢逐漸減少，需要重新脫毒。脫毒懷地黃一代、二代、三代、四代種苗的大田生長葉片進行了病毒檢測，一代和二代沒有感染病毒，從第三代開始感染病毒，第三代的感染率為60%，第四代的感染率為100%［40］。

3.1.2 對產量的影響 脫病毒后的藥用植物產量明顯提高。杭白菊脫毒種苗在分枝數、有效花朵數、葉綠素相對含量參數方面與常規苗有顯著性差異，脫毒早小洋菊單產達490.1 kg/667m2，脫毒小洋菊單產達1 083.3 kg/667m2，分別增產11%和29%［28］。祁菊花脫毒后，菊花的花朵數增加，花的干物質產量顯著提高，增產幅度為37%～50%［41］。脫毒微型半夏種莖播種后產生的C2 代與野生種莖相比具有顯著的生長優勢，產量達1 148.48 kg/667m2，增殖系數為5.74，產量是野生種的2.02 倍，與野生種莖相比產量具有顯著差異［42］。薄荷新品種阜油1 號脫病毒苗鮮草量增加3 654.15～7 564.35 kg/hm2；出油率提高0.3%～2.3%，在界首市、太和縣示范基地大田種植增產達30%［43］。盆栽麥冬脫毒苗結果發現，單株產量脫毒苗與未脫毒苗分別為4.87、3.36 g，產量增加44.9%［37］。太子參的3 種組培脫毒種苗參根產量均顯著優于對照［36］。

隨著脫毒種苗在田間的種植，種苗的世代增加，病毒也會不斷在體內積累，導致產量逐漸下降。脫毒懷地黃苗的塊根產量提高、品質改善，增產幅度在77.35%以上［38］。脫毒懷地黃不同世代脫毒種苗在大田生長中不斷感染病毒，脫毒一代、二代、三代、四代種苗單產、梓醇和毛蕊花糖苷含量均依次下降，其中單產分別為 5 603.90、4 359.50、3 992.50、3 258.20 kg/hm2［40］。

有些無性繁殖的品種，第一代脫毒種苗由于母體往往偏小，在第二代得到恢復，產量會增加。脫毒玄參子代高產試驗中脫毒玄參產量比未脫毒玄參產量平均增產30%。三代、二代、一代種苗均較未脫毒種苗有顯著差異。并且三代種苗產量高于二代，二代高于一代，這可能是脫毒玄參在栽培中復壯引起［44］。從生長發育（農藝性狀、生理生化特性）、產量和品質方面，對懷黃菊一代、二代、三代脫毒苗進行比較研究，二代種苗產量最高、品質較佳，為最佳種植代數。懷菊花脫毒苗規?；a采用二級繁育技術體系［45］。因此，脫毒中草藥種苗在使用過程中既要注意病毒的檢測，確保使用無毒苗，同時也要比較不同世代的產量，發揮其增產的優勢。

3.1.3 對藥效分成含量的影響 中藥材有效成分的含量高低和穩定性是其治療效果的基礎，也是中草藥種植的最基本的要求。脫毒種苗的后代生長旺盛、整齊一致，在增產的同時，其穩定性增加，有效成分也增加。半夏塊莖鮮汁中分離的半夏蛋白是半夏抗腫瘤和抗生育等藥理作用的有效成分，脫毒半夏塊莖中蛋白平均含量為2.86%，比常規的半夏塊莖中蛋白含量高0.3%［46］。脫毒‘早小洋菊’和‘小洋菊’中總黃酮和綠原酸含量高于常規苗，綠原酸含量高于藥典的規定［28］。脫毒懷地黃苗的塊根產量提高，品質改善，增產幅度在77.35%以上，藥用成分梓醇含量提高了32.90%［38］。3 種太子參組培脫毒苗的參根氨基酸總量都明顯分別高于對照苗［36］。

3.2 脫毒種苗的現狀

3.2.1 健康種苗生產現狀 標準的脫毒種苗生產流程，是中草藥種苗脫毒質量穩定的基礎。相比果樹和花卉以及大宗農作物，中草藥品種的特異性、當前中草藥育種水平和種植規模限制了其應用。組培技術是脫毒的一個關鍵環節，在保障種苗質量的基礎上，對組培過程中培養參數的改良，相應地降低了生產成本，可使中草藥種苗脫毒技術更為廣泛地推廣應用，可以有效促進中草藥的生產。改良地黃組培及快繁培養基配方，可降低試管苗生產成本47%左右，縮短繼代時間以及組培和常規營養繁殖相結合，提高了快繁的速度和系數［47］。在目前育種水平低下的情況下，利用脫毒技術與組培工廠化育苗可以迅速開展良種的選育和擴繁。

中草藥種苗脫毒育苗流程：選取種性優良的健壯單株→確定所需脫毒病原菌的種類→優化病原物清除方法→選擇綜合方法進行病原物的去除→根據脫毒品種建立相應組織培養體系→叢生芽的誘導與增殖→外植體材料病原早期檢測→健康種苗增殖擴繁→一級苗圃假植與擴繁→大田一級種苗田擴繁→病原檢測→合格種苗→大田二級種苗田擴繁或在生產上推廣應用［48］。部分中草藥品種存在二代苗的產量高于原種，在生產上根據種苗生長的特點選擇合適的世代苗作為種苗。其中，懷黃菊二代脫毒苗產量在三個世代中最高、品質較佳，為最佳種植代數，在懷菊花脫毒苗規?；a采用二級繁育技術體系［45］。脫毒苗的生產中要做好病蟲害防控，嚴格開展病毒的檢測，確保生產用種的質量。

3.2.2 脫毒種苗的產業發展現狀 生產上使用的脫毒種苗作為生產用種的較為成熟，但是在中草藥上還不多，僅有菊花、半夏、地黃、羅漢果和太子參等進行了生產試驗。其中，健康種苗的成本是目前影響其規?；瘧玫闹饕拗埔蛩?。高效的種苗生產體系對降低種苗生產成本至關重要，體系主要包括種植的基質、肥料和密度等。在基質方面，黃壤土使用方便，生產成本低，選用含水量在20%～30%的疏松黃壤土作為半夏組培苗的基質易獲得高產，并且，基質保持水分能力越強，產量越高，基質保持水分能力越弱，產量越低［42］。同時，種苗的種植密度是影響中藥材產量最重要的因素，半夏組培苗種植密度大時，多小塊莖，少大塊莖；密度小時則相反。因此，在半夏微型塊莖繁殖生產時，需要增加移栽密度從而提高其繁殖的系數。在生產上脫毒種莖的適宜移栽密度為200 株/m2，其C2代產量可達1 148.48 kg/667m2，種苗增殖系數為5.74，產量是野生種的2.02 倍，具有顯著的生長優勢［42］。懷地黃脫毒苗在生產上，其冠幅、葉片數和葉片面積隨著種植密度增加而減少。生產上其種植密度宜為20 000 株/667m2，其株高、產量和藥用成分梓醇的含量最高，鮮質量為6 105.80 kg，干質量為1 393.30 kg，梓醇含量2.86%［49］。脫毒懷地黃苗塊根產量提高、品質改善，增產幅度在77.35%以上，藥用成分梓醇含量提高32.90%［38］。

脫毒種苗的生長與營養條件密切相關。在氮磷鉀復合肥1 687.5 kg/hm2，較適宜脫毒懷地黃苗的生長發育，懷地黃苗的功能葉面積（8 月份）和冠幅（9 月份）最大，葉綠素總含量、凈光合速率和蒸騰速率也最高［50］。生產上脫毒種苗的產量根據中草藥品種的特性而增產的方式不同。其中，生育期延長、植株生長快、健壯、分叉多、花數多和單花干重高等是脫毒菊花苗增產的主要因素［41］。而杭白菊、祁菊花脫毒種苗在分枝數、有效花朵數、葉綠素相對含量、花的干物質產量顯著性高于常規種，增產10%～50%［28，41］。麥冬脫毒苗盆栽結果發現，其分蘗速度快，分蘗數增多明顯，有效塊根數增加，單株產量脫毒苗與未脫毒苗分別為4.87、3.36 g，產量增加44.9%［37］。通過莖尖和愈傷組織脫毒的太子參種苗，在種植過程中生長速度和參根產量根氨基酸總量顯著優于對照苗［36］。脫毒苗在生產上作為種苗，其存在后期重新感染病毒的風險，因此在脫毒苗的種植過程中脫毒苗的代數需要科學控制。其中，脫毒懷地黃種苗在大田種植過程中，前兩代沒有病毒感染，而從第三代開始感染病毒，感染率達到60%，第四代則完全感染；并且隨著病毒感染率的上升，產量、梓醇和毛蕊花糖苷含量均依次下降，脫毒的優勢喪失［40］。

4 展望

目前，很多中草藥品種都是通過無性繁殖方法進行種苗培育，如丹參、半夏、菊花、地黃、春砂仁、羅漢果、紫菀、白芷和太子參等，由于多年的自繁自育，種苗培育缺乏科學指導和統一標準，大多數品種在種植過程中都已經感染病毒或病菌。病毒和病菌往往和種苗伴生，加之，生產上缺乏高效的防治方法，帶毒種苗導致中草藥種植過程中管理困難和成本增加等危害，嚴重制約中草藥的標準化種植和種植效益的提升。健康種苗是提高這類中草藥生產效益最為有效的方法之一。植物目前商業化的脫毒試管苗在果樹、蔬菜、花卉及藥用植物上的應用已經非常廣泛，并取得了良好的效益，如香蕉、木瓜、馬鈴薯、甘薯、草莓和金線蓮等。在中草藥的脫毒技術上可使用的傳統方法較多，但效率相對較低，而且個別病毒不能完全清除［37］。一般生產上基于莖尖組織培養的脫毒效果最為徹底，也得到越來越多的研究與應用。隨著技術的發展，綜合脫毒方法在健康種苗上的應用逐漸增加。其中，組織培養結合熱處理或病毒抑制劑處理將是健康種苗培育的有效途徑［3］。其中，組織培養技術要求較高，受到的限制因子較多，其中植物的遺傳特性、外植體的生理狀態和所清除病毒或病菌的種類是影響脫毒效率的主要因素。培養過程中，培養基的組分、溫度和光照都直接影響組培苗的生長和發育［38］。培養基組分也與脫毒的效率相關，含有高濃度6-BA 的培養基可加快半夏莖尖細胞的分裂速度，抑制了病毒向莖尖部位的移動或積累而脫毒更加徹底［5］。因此，不斷改進植物組培脫毒技術以適應大規模的工廠化和商品化勢在必行。隨著中醫藥事業對中藥材需求的日益增加，推廣健康種苗是有利于中草藥種植的綠色種植和可持續發展。因此，應加大中藥脫毒苗研制技術的投入，建立脫毒方法，提高脫毒和繁殖效率，降低生產應用成本，提高種植者的效益。同時，加大中草藥健康種苗的大面積產業化應用和推廣，促進中草藥種業的升級和中藥農業的高質量發展［37］。