miRNA let-7a在卵巢癌中的研究進展

全麗妮 綜述 黃守國 審校

中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院婦產科，海南 海口 570208

卵巢癌(ovarian cancer，OC)因其發病隱匿、缺乏早期診斷方法，致使多數患者就診時已是疾病中晚期，五年生存率低于45%，使之成為女性第七大最常見的腫瘤及婦科惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一[1]。目前發現絕大多數的人類基因組將被轉錄成非編碼RNA，這種RNA 不具備明顯蛋白質編碼能力，再根據其大小是否超過200 個核苷酸分為長鏈非編碼RNA和小非編碼RNA[2]。其中miRNA 作為小非編碼RNA的一種，普遍存在于真核生物體內，單個miRNA 可以通過同時靶向調控多個mRNA基因，影響其轉錄后活性在細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學功能中發揮重要作用[3]。而異常表達的miRNA 通過解除對癌基因或抑癌基因的調控，與腫瘤的發生、發展以及化療耐藥等密切相關[4-5]。同時也說明miRNA可以作為惡性腫瘤早期診斷標志、治療以及評價預后的一種手段的潛力。現就miRNA let-7a在卵巢癌領域的研究進展進行綜述。

1 miRNA let-7a的概述

miRNA let-7 最早是在秀麗隱桿線蟲中被發現，是第二個被發現的miRNA，也是線蟲從幼蟲到成蟲形態轉變的關鍵調控因子。miRNA let-7家族由10個成熟的亞型組成，而let-7a 是這個家族中重要的成員之一。它們最初在發夾環中以pri-miRNA 的形式表達，堿基由RNase Ⅱ酶Drosha 剪切，形成前miRNA(pre-miRNA)。然后，前miRNA 從細胞核轉移到細胞質，并在細胞質中被另一種RNaseⅡ酶Dicer 與TRBP(the HIV-1 TAR RNA binding protein)合作將其環狀區域切割，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA 又被整合到RNA 誘導沉默復合物(RNA inducing silencing complex，RISC)中，通過與mRNA的3’端非翻譯區特異性結合致使其翻譯終止，從而在轉錄后水平調控基因表達，進而參與細胞分化、增殖、凋亡、個體發育、機體代謝以及病毒感染等過程[6-8]，是多種惡性腫瘤發生發展的重要調控因子，如結腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、骨肉瘤、胰腺癌等，推測其與腫瘤的發生發展關系密切[9-11]。探討miRNA let-7a 在卵巢癌的發生發展中的作用機制，對實現卵巢癌早發現、早診斷、早治療及預后評估過程中尋找新的分子靶標有著重要意義[12-13]。

2 miRNA let-7a在卵巢癌中的表達及其與卵巢癌的早期診斷

近年來隨著基因芯片技術的發展，差異表達的miRNA在腫瘤研究中被廣泛應用。可以通過miRNA的差異表達譜對正常組織與腫瘤組織進行區分。并且miRNA廣泛存在于人類及其他哺乳動物的血液、尿液及其他體液中，并在血清中穩定性較高，不易被內源性RNA酶降解。而腫瘤組織中差異表達的miRNA也能類似地反映在患者的血液中。因此，檢驗腫瘤患者血液中miRNA 的表達情況可以作為一種侵入性診斷指標為腫瘤的診斷提供一定的依據。

通過應用微陣列等方法對卵巢上皮性癌和正常卵巢組織進行miRNA 篩查，發現miRNA let-7a 在卵巢上皮性腫瘤中表達下調[14]。對卵巢癌患者血漿中的miRNA let-7a 表達水平進行研究，進一步證實了miRNA let-7a 在卵巢癌組織中呈現低表達，并且通過ROC 曲線與Ca125 進行比較，結果表明miRNA let-7a對卵巢癌具有較高的診斷價值，可以作為輔助診斷卵巢癌的指標[15]。但由于miRNA let-7a并不是卵巢癌的特有標志，其作為卵巢癌診斷的標志物仍然需要結合其他腫瘤標志物和臨床資料，因此不能單獨用于卵巢癌的診斷，但可以利用它來提高診斷的靈敏度和特異度，為卵巢癌的早期診斷作出一定貢獻。

3 miRNA let-7a與卵巢癌的發生發展

miRNA let-7a 已被發現與多種腫瘤類型相關，是腫瘤發生、發展的重要調控因子[16-18]。但miRNA let-7a在人類腫瘤中具體發揮何種作用，目前存在兩種觀點：多數研究表明miRNA let-7a在人類腫瘤中呈現低表達，發揮抑癌作用，如乳頭狀甲狀腺癌、結腸癌[9-10]等。但也有報道稱miRNA let-7a 在某些腫瘤中可作為癌基因發揮作用[9]。而在卵巢癌中，miRNA-let7a呈現低表達，發揮抑癌作用。但其在卵巢癌中的抑癌作用機制，目前報道較少[12，19]。

細胞自噬是細胞在缺血/缺氧的條件下自我吞噬內部成分的細胞學現象，是一個細胞清除系統。適度的自噬能讓細胞獲得生命必須物質，介導細胞逃避不良生活環境[20]。在腫瘤的發展中，自噬發揮著雙刃劍的作用：一方面通過介導損傷修復機制抑制腫瘤的形成；另一方面，通過自噬介導的大分子回收幫助腫瘤細胞抵抗外部壓力，并為腫瘤的生存提供能量和原料[21]。為了探討在缺氧條件下卵巢癌細胞miRNA let-7a 的表達情況及其對缺氧細胞自噬/增殖的影響，有學者通過構建缺氧模型，對卵巢癌HO-8910細胞進行miRNA let-7a-mimics 轉染、自噬細胞測定、檢測細胞增殖及相關蛋白表達情況等一系列實驗[22]。結果顯示在缺氧狀態下，卵巢癌細胞中的miRNA let-7a呈低表達，并且細胞在經過缺氧處理后自噬水平顯著升高，細胞增殖輕度抑制；當上調miRNA let-7a 表達水平后，細胞自噬明顯減弱，細胞增殖受到明顯抑制。而這種變化關系與自噬相關蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ等的表達相符，可以初步證明miRNA let-7a與細胞自噬有著密切的調控關系，也可初步推斷卵巢癌細胞在缺氧狀態下可通過調控miRNA let-7a 的表達啟動細胞自噬保護作用介導細胞逃避缺氧環境，利于腫瘤細胞的增殖。為了更進一步了解miRNA let-7a 與細胞自噬在卵巢癌細胞中的關系，最近有學者研究發現Beclin1 依賴/不依賴的自噬能夠增加卵巢癌細胞miRNAlet-7a-3p 的表達，但在miRNAlet-7a-3p模型中自噬標志物如LC3B-Ⅱ的表達并沒有明顯增加，而下調miRNAlet-7a-3p 也沒有顯著影響細胞自噬，這表明miRNAlet-7a-3p 可能是自噬的下游效應信號，且對自噬沒有明顯的反饋效應[23]。該研究結果顯示Beclin1依賴/不依賴的自噬通過下調泛素結合蛋白SQSTM1/p62使miRNA加工酶Dicer1和miRNA效應劑AGO2減少，進而增加miRNAlet-7a-3p 的表達最終抑制卵巢癌細胞遷移。關于miRNA let-7a 在自噬中的作用，FAN等[24]通過對Western blotting以及免疫印跡法確定上調表達的miRNAlet-7a 可以增強胃癌細胞的自噬水平，而抑制miRNAlet-7a 的表達將導致細胞自噬活力降低，此后通過生物信息學數據分析以及一系列研究證實在胃癌細胞中，miRNAlet-7a 通過靶向Rictor 調控Akt-mTOR信號通路進而調控細胞自噬。這一結果與LIAO等[23]的研究略有出入，但miRNAlet-7a在細胞自噬中到底是上游調控信號還是下游效應分子，還需要進一步研究。

高遷移率族蛋白2(the high-mobility group AT-hook protein gene，HMGA2)參與細胞分化、胚胎發育以及腫瘤轉化等多種生物過程[25]，且在三大數據庫(TargetScan、miRanda、PicTar)中均被預測為miRNAlet-7a的潛在靶點。MiRNAlet-7a 與HMGA2 的直接調控關系已經在肺癌[26]、乳腺癌[27]、食管癌[28]以及鼻咽癌[25]等中得到證實，但都是從信號通路水平進行探討。在卵巢癌中，國外學者從基因失衡的角度研究基因失衡對miRNA let-7a 在卵巢癌中的影響，結果發現在基因組異常的樣本中，76%的樣本存在至少一個染色體畸變，導致miRNA let-7a基因簇的缺失，使miRNA let-7a在卵巢癌中低表達，從而導致miRNA let-7a 對HMGA2調控解除而高表達，促進卵巢癌的發生發展[29]。并且miRNA let-7a基因簇缺失主要發生在位于22q13.31上的MIRLET7A3，且這種缺失不論在良性還是惡性卵巢腫瘤中均存在。更進一步強調miRNA let-7a 基因簇的缺失在卵巢癌發生發展中的重要性。

4 miRNA let-7a與卵巢癌的化療耐藥

目前，卵巢癌的標準治療方法為減瘤手術及后續以鉑類及紫杉醇為基礎的聯合化療，雖然取得了一定的成果，但疾病結局依然令人失望，許多患者因疾病復發而死亡[30]。而腫瘤對化療藥物產生耐藥性是影響腫瘤療效的重要阻礙因素之一，miRNAs 在其中發揮重要作用。有報道表明，過表達的miRNAlet-7a 可使體外培養的耐藥乳腺癌細胞對表阿霉素敏感[31]。研究發現在體外和體內實驗中miRNAlet-7a對胰腺癌細胞的增殖、轉移和吉西他濱藥物敏感性均有抑制作用[8]。

而miRNA let-7a 在卵巢癌化療敏感性/耐藥性中發揮何種作用呢？有研究對178例接受鉑化療并接受紫杉醇化療和只接受鉑化療而不使用紫杉醇的卵巢癌患者的腫瘤組織中的miRNA let-7a 進行qPCR 檢測，并進行生存分析，發現對鉑類及紫杉醇聯合化療敏感的患者miRNAlet-7a的表達水平明顯低于對化療不敏感的患者。生存分析結果顯示：當患者只接受鉑類化療時，高表達miRNA let-7a的患者生存期優于低表達患者；而當患者接受鉑類+紫杉醇聯合化療時，結果完全相反，miRNA let-7a 高表達患者的無進展期和整體生存期較miRNAlet-7a低表達者短[32]。同一實驗進一步研究，發現miRNA let-7a 低表達患者中，接受聯合化療的患者生存期比單一接受鉑類化療的患者更好；而在高表達miRNA let-7a 患者中，不同的化療方案對生存期影響不大。這一結果表明卵巢癌患者miRNAlet-7a 的表達可能干擾化療療效，可以通過檢測患者miRNAlet-7a 的表達選擇更好的化療方案，為臨床治療提供新思路[32]：當患者被檢測出miRNA let-7a 低表達時，選擇鉑類+紫杉醇聯合化療；而當患者miRNA let-7a 相對高表達時則選擇鉑類單一化療。但這一思路是否能得以實現，以及在這一思路指導下的化療方案選擇的miRNA let-7a 的表達水平如何量化？怎么界定？這是一個值得思考的問題，需要更進一步研究探討。

趨化因子受體4 (CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在多種腫瘤細胞中高表達，并被發現其與miRNA let-7a 間可能存在靶向調節關系，并通過調控miRNA let-7a 的表達影響腫瘤細胞(如急性髓細胞白血病、鼻咽癌等)的化療耐藥性，但這一作用在卵巢癌中鮮有報道[8，33]。最近有學者研究發現在卵巢癌中，高表達的CXCR4 抑制miRNA let-7a 的表達進而促進凋亡抑制基因BCL-XL 的表達，最終導致卵巢癌細胞SKOV3 及Caov3 對順鉑耐藥性增強[12]。這是首次在卵巢癌中探討CXCR4 對miRNA let-7a的調控作用，以及它們對卵巢癌細胞順鉑耐藥性的影響。

5 miRNA let-7a與卵巢癌的預后

為了更深入的研究miRNA let-7a 與卵巢癌化療敏感性及預后的關系，有學者采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(PCR)技術對211 例卵巢上皮性癌組織中的Lin-28b/miRNA let-7a 和IGF-ⅡmRNA 進行分析，并進行分類和回歸樹分析(cart)及生存分析，結果發現在上皮性卵巢癌中，所有高表達Lin-2b 的患者和Lin-28b低表達或miRNA let-7a及IGF-Ⅱ高表達的患者復發風險及總體死亡率均高于其他患者；而Lin-28b 和miRNA let-7a 均低表達的患者對化療反應較好。這些結果表明，Lin-28b/let-7a/IGF-Ⅱ軸的分子亞型與異質性進展相關，可能對預測上皮性卵巢癌有臨床意義[34]。

人腫瘤睪丸抗體(HIWⅠ)又被稱為PIWI樣蛋白1(piwi-like ran-mediated gene silencing 1，PIWIL1)，是argonaute 蛋白家族成員，在人體組織中廣泛表達，與人干細胞自我更新、RNA 干擾密切相關，并影響腫瘤的增殖和預后[35]。通過對HIWⅠ免疫共沉淀測序，結果表明HIWⅠ與miRNA let-7a相互作用，調控基因表達[36]。因此，為探討miRNA let-7a 與HIWⅠ在評估上皮性卵巢癌預后的作用意義，采集211 例上皮性卵巢癌患者的腫瘤組織，對腫瘤組織中的HIW Ⅰ及miRNAlet-7a的表達及其與卵巢癌預后的關系進行研究，結果發現在miRNA let-7a 高表達的患者中，中度表達HIWⅠ的患者較較低或較高表達HIWⅠ的患者，其死亡風險明顯增加，調整后的HR 為2.62 (95%CI：1.30～5.30)。而那些低表達miRNA let-7a 的患者中的死亡風險與HIWⅠ的表達無明顯相關性，調整后HR為1.63 (95%CI：0.86～3.08)。表明HIWⅠ和miRNA let-7a的表達對卵巢上皮性癌的總體生存期也有協同作用，HIWⅠ和miRNA let-7a可能對上皮性卵巢癌的預后有臨床意義[37]。

6 展望

隨著miRNA與卵巢癌相關性研究的不斷深入，越來越多的miRNA被人們所熟知，同時其下游靶基因或靶點以及上游調控基因也在不斷被發現，旨在探索miRNA 與腫瘤發生、發展的分子機制，以便在腫瘤的早期診斷、治療及后續的預后評估發揮重要作用。

競爭性內源RNA(ceRNA)并不是新的RNA，而是一種新的基因表達調控模式，首先由POLISENO 等[38]提出這一概念。在ceRNA 理論假說中，RNA 只要擁有miRNA 反應元件(miRNA response element，MRE)結構都可以成為ceRNA，包括circRNA、lncRNA、mRNA 以及假基因轉錄物等，且ceRNA 可以通過與miRNA競爭性結合來調控基因表達，進而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移以及化療敏感性/耐藥性[39]。那么miRNA let-7a在卵巢癌的發生、發展中所發揮的作用是否也受到ceRNA 的調控呢？目前關于這一問題鮮有研究。因此，對miRNAlet-7a 及可能涉及的ceRNA 機制在卵巢癌中的具體作用機制及化療敏感/耐藥機制進行深入研究，將為卵巢癌的生物學行為發生機制積累更多的分子理論基礎，為卵巢癌的診斷和預后評價提供新的分子標志物，為卵巢癌的治療方案選擇提供新的思路。