超快速turn-on型ClO-熒光探針的合成及性能

劉艷玲

(呂梁學院化學化工系，呂梁 033001)

次氯酸(HClO)或次氯酸根(ClO-)是生物體中重要的活性氧(reactive oxygen species，ROS)之一[1-2]，在生物體的細胞、組織、器官中普遍存在，其存在有助于使入侵的細菌失活，抑制DNA復制，減少細胞組織的細菌污染，抑制傷口感染。生物體中的HClO或ClO-分為內源性和外源性，內源性HClO或ClO-由白細胞(包括巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞)中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)催化過氧化氫和氯離子反應而生成；外源性的HClO或ClO-主要是水的氯化消毒產生(Cl2+H2O→HClO)，存在于生活飲用水、醫院等各種公眾場所的消毒液中[3-6]。最近2年來，受新冠疫情的影響，消毒液的使用增加了人們暴露于ClO-中的機會，接觸到的ClO-的濃度也隨之增大，而HClO或ClO-濃度異常(ρ≥1 g·L-1)則會引起體內生物分子氧化，進而導致各種生理疾病，包括關節炎、動脈粥樣硬化、肝硬化和癌癥[7-11]。

對與疾病相關物質的原位檢測以及生命和化學反應過程中一些精細和中間過程的快速和高分辨監測，是目前生物學和化學面臨的重要科學問題。基于有機小分子的熒光探針具有低成本、結構簡單、生物兼容性好、發光性能易調控、反應機制易闡明等優勢，同時，熒光探針體現出可視化、非破壞性、多層次成像等優點，能夠實現在細胞或活體中目標分子的實時、定位檢測，因此被廣泛應用于生物學、環境學和醫學等領域。

依據熒光探針對分析對象的識別方式不同，熒光探針可分為傳統型熒光探針和反應型熒光探針。傳統型熒光探針與分析對象通過非共價的相互作用(氫鍵、靜電作用、配位作用、疏水作用和范德華力等)相結合，進而改變熒光探針的熒光信號。與傳統型熒光探針相比，反應型熒光探針憑借不可逆性、特異性和生物正交性等優勢，提高了其對分析對象的選擇性和靈敏度[12]。近年來，識別HClO的反應型熒光探針快速發展，按其識別機理主要可分為氧化脫肟基反應[13-15]、氧化硫族化合物反應[16-18]、氧化酰肼反應[19-20]與氧化脫氫反應[21-22]等。但熒光探針仍存在合成路線復雜、檢出限過高、抗干擾能力差等缺點，要實現熒光探針在細胞器中靶向檢測HClO或ClO-仍然是目前生物化學研究的重要內容[23-25]。為此，我們以2，7-二溴-9-芴酮為原料，通過兩步反應合成了一種新型的turn-on型熒光探針，并研究了其對ClO-的檢測性能。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所用儀器有F-7000熒光分光光度計、U-3900紫外可見分光光譜儀、AB Triple TOF 5600 plus System氣相色譜質譜聯用儀、Bruker AVANCE-600 MHz核磁儀、二氧化碳培養箱、Zeiss LSM 880激光掃描共聚焦顯微鏡。所需要的藥品和試劑均采購于上海阿拉丁試劑公司。

1.2 合成及表征

探針的合成路線如Scheme 1所示。將化合物2，7-二溴-9-芴酮(338 mg，1 mmol)和苯酚(940 mg，10 mmol)加入甲磺酸(5 mL)溶液中。將混合物在60℃攪拌6 h，冷卻，倒入水中層析并過濾后，用乙醇洗滌，得到白色固體化合物1(414 mg，82%)。

將1 g化合物1加入三氟乙酸(TFA)15 mL，然后再加入六次甲基四胺0.4 g，加熱至70℃，反應6 h，然后旋轉蒸發除去三氟乙酸，將所得混合物加入冰水中，用二氯甲烷萃取，以碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用二氯甲烷和石油醚(1∶5，V/V)進行柱色譜純化，得到的產物為白色固體化合物2，即為目標探針(900 mg，81%)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ 10.83(s，2H)，10.16(s，2H)，7.95(d，J=8.0 Hz，2H)，7.64(d，J=8.0 Hz，2H)，7.56(s，2H)，7.39(d，J=8.5 Hz，2H)，7.25(s，2H)，6.98(d，J=8.6 Hz，2H)。13C NMR(151 MHz，DMSO-d6)：δ 191.59，160.55，152.95，138.11，136.50，135.14，131.74，128.84，127.23，123.52，122.30，121.92，118.65，64.02(圖 S1～S3，Supporting information)。ESI-MS m/z：[M-H]-計算值 562.932 2，實測值562.932 6。

Scheme 1 Synthetic route of probe 2

2 結果與討論

通過實驗我們確定了探針識別反應的最佳條件：磷酸緩沖鹽溶液(PBS，20 mmol·L-1，pH=7.4)和乙腈的混合溶液(1∶1，V/V)，激發波長為410 nm，發射波長為511 nm，激發狹縫寬度/發射狹縫寬度為5 nm/5 nm。以下相關實驗均在此反應條件下進行。

2.1 探針識別ClO-的pH條件

首先，我們研究了不同pH值(2～6)和生理環境(pH=7.4)條件下，探針2對ClO-的光學響應。如圖1所示，在pH=2～6的體系中，探針2在加入ClO-前后其熒光強度幾乎沒有變化，而在生理條件下，加入ClO-后2的熒光強度變化很大，故該探針適合在生理條件下檢測ClO-。

圖1 存在和不存在ClO-時pH對探針2的熒光的影響Fig.1 pH effect on fluorescence of probe 2 in the absence and presence of ClO-

2.2 探針識別ClO-的選擇性

接下來，我們選擇了一些人體中常見的分子和離子，如K+、Na+、NO2-、Br-、F-、Cl-、HSO3-、SO32-和生物硫醇 Cys(半胱氨酸)、Hcy(同型半胱氨酸)、GSH(谷胱甘肽)，以及具有氧化性的H2O2作為分析物，所加分析物濃度都是ClO-濃度的2倍，且與探針2的共存時間為5 min(ClO-的反應時間為10 s)，結果見圖2。由圖可知，探針2對ClO-有明顯的選擇性檢測作用，其他分析物和2共存時對其熒光基本沒有影響。

圖2 探針2對ClO-的選擇性檢測Fig.2 Selective detection of ClO-by probe 2

2.3 探針識別ClO-的光譜研究

向探針2的PBS/乙腈溶液中逐漸加入濃度為0.1 mol·L-1的 ClO-溶液(每次 50 μL)，其 UV-Vis吸收光譜的變化見圖3。可以看出，隨著ClO-溶液濃度的增大，410 nm處的吸收峰逐漸增大，當加入的ClO-溶液總體積為150 μL后，吸收峰不再發生變化(圖S4)。而在320和340 nm處的吸收峰是隨著ClO-溶液濃度的增大而逐漸減小的。

圖3 ClO-濃度對探針2的UV-Vis光譜的影響Fig.3 Effect of ClO-concentration on UV-Vis spectra of probe 2

向探針2的PBS/乙腈溶液中逐漸加入濃度為0.1 mol·L-1的 ClO-溶液(每次 0.5 μL)，其熒光光譜的變化如圖4所示。由圖可見，隨著ClO-溶液濃度的增大，探針2在511 nm處的發射峰強度逐漸增大，當ClO-溶液加入量超過2.5 μL后，發射峰強度不再發生變化(圖 S5)。

圖4 ClO-濃度對探針2熒光強度的影響Fig.4 Effect of ClO-concentration on fluorescence intensity of probe 2

2.4 探針識別ClO-的動力學、檢出限和響應機理

用熒光光譜法研究探針2識別ClO-的反應時間，結果如圖 5所示。當 10 μmol·L-1的探針溶液和125 μmol·L-1的 ClO-溶液反應，反應在 10 s內即完成，10 s后熒光強度不再變化。而且從圖中可以看出，空白實驗中探針很穩定，其熒光強度基本不變。

在 10 μmol·L-1的探針體系中逐次加入 0.5 μL濃度為 0.1 mol·L-1的 ClO-溶液，使其濃度為25～125 μmol·L-1，用熒光強度對 ClO-溶液濃度作圖(圖6)，對數據進行線性擬合，求其斜率k，根據文獻[9]計算檢出限LOD，其值為0.74 μmol·L-1。

通過高分辨質譜研究了探針2對ClO-的響應機理。如圖S6所示，當探針和ClO-反應完畢后，我們通過高分辨質譜找到了響應產物的質譜峰，該產物可認為具有苯醌結構，我們推測可能的機理是ClO-將探針氧化成苯醌的結構從而導致熒光強度增大。

2.5 探針識別ClO-的細胞成像

通過激光共聚焦顯微鏡考察了探針2在Hela細胞內對 ClO-的響應。用 10 μmol·L-1的探針孵育Hela細胞 20 min后，加入50 μmol·L-1的ClO-溶液繼續孵育。隨后用PBS洗滌細胞3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。如圖7所示，綠色通道有明顯的綠色熒光。當我們用脂多糖(LPS)刺激細胞產生內源性的ClO-，也會有綠光出現。因此，我們的探針可以在細胞內檢測內源性和外源性的ClO-。

圖7 探針2在Hela細胞內對ClO-響應的熒光成像圖Fig.7 Fluorescence images of probe 2 responding to ClO-in Hela cells

3 結論

本研究提供了一種在生物體系中快速檢測ClO-的方法，該方法對ClO-有單一選擇性，熒光強度明顯，10 s內快速完成反應，且檢出限低至0.74 μmol·L-1。此外，探針還可以在HeLa細胞中實現ClO-的熒光成像，為今后ClO-的實時檢測提供了有價值的參考。

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