寒蘭CONSTANS-LIKE基因表達水平及光周期響應分析

應震，周莊，楊燕萍，付雙彬，徐碗

(浙江亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325000)

寒蘭(CymbidiumkanranMakino)植株修長優美，花色豐富，香味清醇，具有極高的觀賞價值、經濟價值和文化價值，為五大國蘭之一，廣泛分布于我國東部、南部及日本和朝鮮半島，在東亞具有悠久的栽培歷史和廣泛的種植基礎。通過實地調查發現，在浙江地區，寒蘭無論種植于室內還是室外，其花期主要集中于10—12月，偶有寒蘭會于春季和夏季開花，花期總體上具有一定的周期性。

隨著分子生物學研究的發展，植物光周期調控開花的分子機理在擬南芥上逐漸揭示，葉片COL基因對光周期響應是植物光周期開花的根本原因[1]。通過深入研究，以COL和FT基因為核心調控元件的光周期調控的開花模型已經在很多植物開花研究中得到了驗證[2]。在蒺藜[3]、菊花[4]、李子[5]、山茶[6]和棉花[7]等植物中已克隆得到對應的FT和COL基因及其同源基因。研究發現，在模式植物中過量表達FT基因可以明顯縮短植物花期；而過量表達COL基因可以明顯上調FT基因的表達水平，同樣起到縮短花期的功能。

寒蘭作為五大國蘭之一，花期與大多數蘭花存在不同，本文擬通過對寒蘭開花的統計分析以及利用已報道的蘭屬、石斛屬[8]和蝴蝶蘭屬[9]COL基因家族信息，對寒蘭COL基因在花期前后表達水平進行分析，擬為下一步開展光周期調控寒蘭的開花系統研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及采樣

寒蘭種植于浙江亞熱帶作物研究所溫室大棚中，定期澆水培養，選擇生長健壯的植株進行實驗，實驗開展時間為5—11月，每第一個月第一周，采集10盆寒蘭葉片，葉片采集并液氮處理后超低溫冰箱保存。

待植株開花后按照是否開花進行樣品分類，并提取RNA，建立cDNA文庫。

1.2 熒光定量引物設計

通過現有蝴蝶蘭和蘭屬已報道的COL基因序列，結合課題組已有寒蘭轉錄組數據，采用bioedit軟件進行比對，獲得兩條相似性較高的寒蘭COL轉錄組序列(c112049.graph_c0和c110006.graph_c0)分別命名為CKMCOL1和CKMCOL2。采用NCBI Primer BLAST在線設計熒光定量引物，篩選得到2對熒光定量引物(COL1-F：TGTTC GCAGGTGTCCTCATC，COL1-R：CGCGTAGCGTAT CGTCTTCT；COL2-F：CCCTTCAAATGGCGCAACAG，COL2-R：AGCGAACCGCCCTTTAATCC)。以ACTIN為內參基因，引物為ACTIN-F：ATGCTCCCAGGG CTGTATTC，ACTIN-R：TACCCCTTTTAGACTGCGCC。

1.3 COL表達水平檢測

采用1.2設計的引物，對采集的樣品進行熒光定量分析，比較兩組之間表達水平差異。

2 結果與分析

2.1 花期前后寒蘭COL基因表達水平分析

通過圖1可以看出，無論是否開花，寒蘭COL1基因在5—7月表達水平都逐漸上升，而8—11月，開花組寒蘭的COL1基因表達水平先快速上升再緩慢下降，與未開花組寒蘭相比，均呈顯著和極顯著差異，由此可見，COL1基因在葉片中的特異性表達與寒蘭開花有密切聯系；而7月開始，光照時間縮短，但溫度較高，因此，推測COL1基因可能參與FT基因的調控，同時也能響應溫度變化。

*—開花組和未開花組之間差異顯著，P<0.05；**—開花組和未開花組之間差異極顯著，P<0.01。

由圖2可知，COL2基因無論在開花組和未開花組，在5—8月都呈現表達水平上升的趨勢，而9—11月呈下降趨勢，與植株開花并無明顯關聯，這說明COL2基因的功能可能是響應溫度的變化。

圖2 COL2基因在開花和未開花植株間表達水平

2.2 COL基因對光暗的響應

圖3顯示，COL1基因在光處理3 h時，表達水平呈現略上升趨勢，但無顯著性差異，而在暗處理條件下，COL1基因隨著處理時間延長表達水平上升，在3 h時，顯著高于對應的光處理條件。由此可以推斷COL1基因既能夠響應溫度變化，同時也能響應光照變化。

圖3 COL1基因在光暗處理下表達水平

圖4顯示，寒蘭COL2基因在光暗處理條件下的表達水平變化，可以看出，無論光處理還是暗處理，COL2基因表達水平變化基本相等，并無明顯的上升和下降，因此，可以推斷COL基因不能響應光周期的變化。

圖4 COL2基因在光暗處理下表達水平

3 討論

COL基因家族在植物中對環境因子進行響應并且對下游的植物生理現象進行調控，這其中包含了花期調控。本研究通過轉錄組大數據篩選，得到了寒蘭的COL1和COL2基因，其中COL1基因不僅具有顯著的光周期調節特性，同時也能對溫度變化進行響應，與寒蘭花期存在相關性；而COL2基因則具有溫度響應的特性，與花期并無顯著相關性。為了繼續深入探究寒蘭COL基因家族的功能，今后需要結合擬南芥等模式植物的轉化技術和轉錄組大數據分析，對其基因功能進行更加深入的了解。