高效液相色譜-串聯質譜法測定水中4種大環內酯類藥物

楊 穎， 楊創濤， 黃慧星

(廣東粵港供水有限公司， 廣東 深圳 518000)

阿維菌素類藥物(avermectins, AVMs)主要來源于鏈霉菌發酵產物的分離提取，屬于大環內酯雙糖類化合物，具有高選擇性和高毒殺蟲性，對各種農業害蟲和動物寄生蟲等有較好的驅殺效果，目前作為一種新型的農畜兩用藥應用較為廣泛[1-2]。然而，該類藥物極容易通過食物鏈富集，會導致運動和中樞神經系統毒性，當前世界衛生組織(WHO)以及包括中國在內的許多國家和地方組織等已將阿維菌素類藥物確定為高毒性化合物，并對其殘留量進行了限制[3-4]。水環境是農牧產業重要的排放受體之一，隨著該類藥物用量的不斷增大，人類飲水安全的風險隱患也在逐步加劇，因此，加強對水環境中阿維菌素類藥物的監測是十分有必要的。

阿維菌素類藥物具有高分子量，較難氣化，目前主要檢測方法是液相色譜-光譜法(熒光法、紫外法)和液相色譜-串聯質譜法，其中紫外法靈敏度低，干擾影響因素多，熒光法涉及衍生化處理，操作復雜，而高效液相色譜-串聯質譜法具有高選擇性和高靈敏度，目前應用日益廣泛[5-6]。當前，我國已出臺高效液相色譜-串聯質譜法應用于飼料、糧食、蔬菜、肉禽等食品中阿維菌素類藥物檢測的標準方法[7-8]，但水質相關的檢測方法則較為少見。筆者采用超高效液相色譜-串聯質譜法，同時測定水中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素，對基質相對簡單的水質樣品，僅需簡單的固相萃取處理即可上機檢測，測定下限可達0.60～0.80 μg/L，靈敏度高，抗干擾能力強，可實現這4種大環內酯類藥物的快速、準確、高靈敏度檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯質譜儀(Waters OA Acquity UPLC TQD MS/MS)；硅膠顆粒色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3：50×2.1 mm,1.8 μm)；氟苯基色譜柱(Waters ACQUITY UPLC CSH：50×2.1 mm,1.7 μm)；亞乙基橋雜化顆粒色譜柱(Waters ACQUITY UPLC BEH C18：50×2.1 mm,1.7 μm)；針頭式過濾器(PTFE，0.45 μm)。

阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素有證標準溶液，100 mg/L，甲醇介質；乙腈、甲酸、醋酸銨，色譜純。

1.2 樣品前處理

對于相對清潔的水樣，直接取上清液進行固相萃取；對于渾濁水樣，預先經0.45 μm濾膜過濾后，再進行固相萃取。

固相萃取步驟如下：依次用3 mL乙腈、10 mL水活化固相萃取小柱(Shimadzu InertSep PLS-3 PLS-3)；取20 mL清潔水樣，添加1%(體積比)乙腈，緩慢過柱后抽干小柱；然后依次使用0.5 mL乙腈進行2次洗脫；合并2次洗脫液后用乙腈定容至1.0 mL，然后添加1.0 mL水配制成(1+1，體積比)乙腈水溶液，混勻后轉移入棕色進樣瓶中待測。

1.3 色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫為35℃；以(0.05 mmol/L乙酸銨+0.1 %甲酸，體積比)水溶液為流動A相，以(0.1 %甲酸，體積比)乙腈為流動B相；進樣體積為10 μL；采用梯度洗脫方式，梯度程序見表1。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.4 質譜條件

離子源：ESI，負離子模式；毛細管電壓：1.00 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；反吹氣流量：20 L/h；多離子反應監測方式(MRM)，具體條件見表2。

表2 多離子反應監測條件

注：帶*的為定量離子對，對于不同質譜儀器，參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優化到最佳。

2 結果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

實驗選擇了Shimadzu GL WondaSep系列的C18、Shimadzu InertSep系列的PLS-3、Waters Oasis系列的HLB等3種不同材質的固相萃取小柱，配制濃度約為5 μg/L的樣品進行富集萃取效果研究。

回收率結果表明，PLS-3小柱的效果明顯優于C18和HLB小柱，使用PLS-3小柱萃取后4種目標藥物的回收率都要高于其他2種小柱近2倍。因此，選定Shimadzu InertSep系列的PLS-3作為固相萃取小柱。

2.2 色譜柱的選擇

實驗研究了Waters ACQUITY UPLC HSS T3、Waters ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl和Waters ACQUITY UPLC BEH C18 這3種不同色譜分析柱對4種目標化合物的分離效果。

結果表明，CSH色譜柱無法將4種目標物分離，且靈敏度偏低；BEH C18和HSS T3可以較好地將4種目標物分離，且BEH C18可獲取更高的靈敏度。因此，選定Waters ACQUITY UPLC BEH C18作為色譜分析柱。

2.3 進樣樣品基質的選擇

實驗對比了純水、(1+1，體積比)乙腈水和純乙腈3種進樣基質條件下的樣品響應靈敏度。結果表明，以(1+1，體積比)乙腈水溶液作為進樣樣品基質有最高的靈敏度響應，純水基質下幾乎沒有響應。因此，選定(1+1，體積比)乙腈水作為進樣樣品基質，該條件下樣品經固相萃取后無需氮吹，可直接用乙腈和水定容，也提升了檢測效率。

2.4 質譜條件的優化

實驗中，以(0.05 mmol/L乙酸銨+0.1 %甲酸，體積比)水溶液和(0.1 %甲酸，體積比)乙腈為流動相，采用電噴霧離子源(ESI+)，對4種目標化合物的質譜條件進行了優化。在確定各化合物的母離子后，采用子離子掃描方式對子離子進行優化選擇，確定了定量離子和輔助定性離子對。通過優化毛細管電壓、錐孔電壓、透鏡電壓、碰撞能量及質譜分辨率等質譜參數，使3種目標化合物信號強度達到最佳。然后，進一步對離子源溫度、脫溶劑氣溫度及流量、錐孔反吹氣流量進行優化，使每種化合物的離子化效率達到最佳，最終確定目標化合物的多離子反應監測(MRM)條件，見表2。

2.5 目標物總離子流圖

在實驗選定的液相色譜和質譜條件下，4種大環內酯類藥物(濃度均為50.0 μg/L) 都實現了有效分離，響應值良好，見圖1。

圖1 4種大環內酯類藥物的總離子流圖

2.6 方法性能指標

2.6.1 線性關系、檢出限和測定下限

采用經優化的分析條件，對不同濃度的標準溶液進行分析并繪制標準曲線。按照《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》(HJ 168—2010)對方法檢出限測定的要求，采用低濃度空白加標水樣(n=7)經固相萃取富集后上機測定，根據分析結果計算其標準偏差SD，檢出限MDL=3.143×SD，定量限為檢出限的4 倍。從表3可以看出，方法的線性相關性好，目標物檢出限在0.10～0.20 μg/L，測定下限在0.40～0.80 μg/L，可滿足水體低濃度樣品的檢測需求。

表3 4種大環內酯類藥物的線性關系、檢出限和定量限

2.6.2 精密度和準確度

對地表水、飲用水2種不同類型的實際水樣中目標化合物的濃度進行測定，結果均為未檢出。同時，在上述2種類型樣品中分別加入不同濃度水平的標準物質，進行低、中濃度水平的加標回收實驗，每個濃度分別平行配制7份樣品，同時計算相對標準偏差和平均加標回收率。結果表明，平行樣間相對偏差在5.6%～12.9%，水樣的加標回收率在84.6%～126%，方法精密度和準確度良好。

3 結論

建立了超高效液相色譜質譜法測定水中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素等4種大環內酯類藥物的分析方法。該方法的樣品固相萃取前處理簡單，有機溶劑用量少，環境友好，檢出限、精密度和準確度令人滿意，能夠滿足水體中大環內酯類藥物的檢測要求。