2株煙草根際芽孢桿菌的分子鑒定及抗菌促生作用

曹毅 李娟 曾隕濤 陸寧 楊冬梅 商勝華

摘要：為探究分離自煙草根際的2株芽孢桿菌的種類及其抑菌促生特性，利用16S rDNA和gyrB基因序列分析法，將菌株YC2006和YC2008分別鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株對煙草赤星病病原（Alternaria alternata）、煙草黑脛病病原（Phytophthora parasitica）和煙草立枯病（Rhizoctonia solani） 病原均具有明顯的抑制作用，對煙草立枯病病原的抑制率分別達到60.35%和68.08%。菌液浸種處理可顯著提高煙草種子發芽勢，在育苗基質中添加菌劑可顯著提高煙苗的株高、莖圍、最大葉面積、地上部鮮質量、地下部鮮質量、總根長和總根表面積。2株芽孢桿菌對煙草主要真菌病原具有拮抗活性，同時兼具促進種子萌發和煙苗生長的作用，具有良好的研究開發應用前景。

關鍵詞：芽孢桿菌;煙草;gyrB基因;抑菌活性;促生作用

中圖分類號：S182;S572.01 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0241-06

收稿日期：2021-03-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31660544）;中國煙草總公司貴州省公司項目（編號：201603、2021XM12）。

作者簡介：曹 毅（1982—），男，云南會澤人，博士，副研究員，從事微生物和植物保護研究。E-mail：yicao1001@163.com。

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國廣泛種植的重要茄科經濟作物，煙草病害嚴重影響煙葉產質量，常年造成的平均產量損失達10%左右[1]，一直是制約煙草生產的主要因素之一，而隨著氣候、耕作制度和栽培方式的變化，煙草病原種類及其危害程度呈增加和上升趨勢。長期以來，作物病害主要依賴化學藥劑，由此導致的藥害[2]、農藥殘留、病原耐/抗藥性、生態環境影響等問題逐年凸顯，利用微生物制劑或其他環境友好措施控制作物病害受到各方廣泛關注。在各類生防微生物資源中，芽孢桿菌由于種類多樣、遺傳穩定、環境抗逆性強[3]，可通過改善植物營養物質吸收、產生激素、誘導抗性和抑制病原生長等方式直接或間接促進植物生長、防治病害[4]，國內外研究者利用芽孢桿菌已開發出多種對植物病原具有防治效果的生物菌劑[5]，并在作物病害防治中不斷發展和應用[6]。

利用微生物防治作物病害雖已取得較大的進展，但在實際生產實踐中，由于外源生防菌在目標作物根系中定殖力低、土壤抑菌作用、施用成本等因素的影響，生防制劑往往防效低且不穩定，篩選根際定殖能力強的菌株資源并研究適合作物生產特點的施用方法對提高生防菌劑施用效果具有重要意義。前人研究表明，利用有益微生物處理煙草種子，可明顯提高種子發芽勢、生長勢和種子活力，促進煙苗生長，增加其抗逆和抗病性[7];微生物添加進育苗基質中，可改善其結構與理化性質[8]，提高養分供應能力，進而促進植物生長[9];同時，菌劑可在植物幼苗根部優先形成“生物屏障”[10]，維持根際微生物群落平衡并抵御病原攻擊[11-12]。煙草育苗集約化程度高，在種子萌發、育苗階段使用微生物菌劑具有經濟和高效的特點，規模化推廣應用潛力大。目前，針對煙草和煙葉生產特點開發的微生物菌劑較少，以高效土著菌株為核心的煙用菌劑及配套使用技術仍較缺乏。

本研究以前期分離獲得的2株煙草根際芽孢桿菌YC2006和YC2008為材料，采用16S rDNA和gyrB基因（DNA促旋酶B亞單位基因）序列分析法對菌株進行鑒定，通過室內和溫室試驗評估2株芽孢桿菌的抗菌和促生能力，以期為煙草抗病促生菌劑的開發應用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養基和煙草品種

試驗所用煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草立枯病菌（Rhizoctonia solani）、芽孢桿菌YC2006和YC2008均由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室分離并保存，LB培養基和PDA培養基分別用于芽孢桿菌的活化和病原真菌培養，試驗用煙草品種為K326，對照為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（云南星耀生物制品有限公司提供）。

1.2 主要真菌病原拮抗活性測定

用平板對峙培養法測定經活化的YC2006和YC2008對煙草黑脛病、赤星病菌和立枯病等主要真菌病害病原菌的拮抗活性，挑取經LB平板活化的單菌落接種于LB液體培養基中，搖床振蕩培養（28 ℃、180 r/min）2 d得到培養液，吸取50 μL培養液緩慢滴入無菌空白濾紙片（索萊寶）中，于PDA平板中接入直徑6 mm 新鮮培養的病原菌菌餅，距菌餅約2.5 cm處等距放入含菌濾紙片，以未接菌的LB培養液為對照，3次重復，28 ℃培養箱中培養 5～7 d后，測量病原菌菌落直徑，計算抑制率：

抑制率=（1-接種處理病原菌菌落直徑/不接種處理病原菌菌落直徑）×100%。

1.3 菌株gyrB基因和16S rDNA序列分析

菌株基因組DNA采用試劑盒（DNeasy UltraClean Microbial Kit，Qiagen）并按說明書方法提取，引物由上海英駿生物技術有限公司合成：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）/UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′），分別用于菌株16S rDNA 和gyrB基因[13]的擴增;PCR擴增體系為50 μL（GoTaqTM Green Master Mix 25 μL、27F/UP-1 1 μL、1492R/UP-2r 1 μL、模板 5 μL、無核酸酶去離子水18 μL）。16S rDNA基因擴增程序為：94 ℃預變性 4 min;94 ℃變性30 s，65 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環;72 ℃延伸 10 min;gyrB擴增條件：94 ℃預變性 4 min;94 ℃ 變性 1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共35個循環;72 ℃延伸10 min。

擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，利用中間引物UP-1s（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′）和UP-2rs（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′）測通gyrB基因全長，測序拼接序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，下載同源性在99%以上的序列，利用Mega X軟件包進行多重序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining，Bootstrap value=1 000）構建系統發育樹。

1.4 煙草種子萌發相關指標測定

取活化的菌株，接入種子培養基中，37 ℃、200 r/min 培養24 h后，制得種子液;以5% 接種量將種子液接種到2 L發酵培養基中，30 ℃條件下發酵48 h，將菌株發酵液與適量CaCO3混合，噴霧干燥后獲得初制菌劑。利用平板稀釋法[14]測定含菌量，菌液YC2006和YC2008的濃度分別約為4.04×1010 CFU/mL和1.83×1011 CFU/mL。將菌液濃度與對照商品化菌劑濃度調至1×109 CFU/mL，備用。

選取煙草種子（K326）放于試驗設置的菌劑溶液中浸種2 h，分別以清水和商品化枯草芽孢桿菌可濕性粉劑為對照，共11個處理（表1）;浸種后，種子置于鋪有滅菌濾紙的滅菌培養皿中，加入滅菌清水保濕，每皿放置30粒種子，每個處理重復3次。25 ℃、光照16 h/d的人工氣候室培養，從種子置床之日起每天定時（早：09：00，晚：18：00）開蓋通氣2次，加入滅菌清水，保證發芽床濕潤。萌發指標以種子露白為準。種子萌發后逐日記錄發芽數量，共記錄10 d，測定并計算種子萌發指標。

發芽率=（萌發結束時已發芽種子數/供試種子總數）×100%;

發芽勢：從種子置于培養箱開始至第3天，統計發芽種子數占供試種子總數的百分率。

1.5 煙草幼苗農藝性狀測定

在前期試驗基礎上，設5個處理組，處理A：每100 g育苗基質中拌入0.5 g枯草芽孢桿菌YC2006;處理B：每100 g育苗基質中拌入2 g解淀粉芽孢桿菌YC2008;處理C：每100 g常規育苗基質中拌入1 ∶1（質量比）的1 g芽孢桿菌YC2006、YC2008;處理D：空白對照，育苗基質中不拌入芽孢桿菌（CK1）;處理E：每100 g育苗基質中拌入0.5 g商品化枯草芽孢桿菌（CK2）。將種子分別播于試驗設置的不同基質中，放置于人工氣候室培養，培養環境設為溫度25 ℃/18 ℃（晝/夜），光照16 h/d，相對濕度75%。播種45 d后，參照標準YC/T 142—2010[15]，對煙苗株高、莖圍、地上部鮮質量、地下部鮮質量、地上部干質量、地下部干質量及最大葉面積等指標進行測定，根系指標采用根系掃描儀（型號：EPSON 1680）及其配套的WinRhizo Pro 5.0根系分析軟件測定[16]。

1.6 統計分析

采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株對主要煙草病原真菌的室內拮抗活性的影響

平板對峙試驗結果表明（表2），YC2006和YC2008菌株對病原菌菌絲的生長具有抑制作用，對2種病原菌的抑制率達45%以上，芽孢桿菌YC2006和YC2008對煙草立枯絲核菌的抑制率最為明顯，分別達60.35%和68.08%;其次為赤星病菌（鏈格孢菌）和黑脛病菌（煙草疫霉）（圖1）。

2.2 菌株16S rDNA和gyrB基因序列系統發育分析

菌株YC2006和YC2008的16S rDNA基因測序結果經序列拼接后，長度分別為1 420 bp和 1 410 bp，采用 NJ 法分別構建2株菌的16S rRNA 基因序列系統發育樹，結果見圖2和圖3。從16S rRNA基因序列系統發育樹看，菌株YC2006和YC2008與臨近的幾株芽孢桿菌親緣關系較為接近，初步將YC2006和YC2008歸為芽孢桿菌屬。

菌株YC2006的gyrB基因測序結果拼接后獲得1 160 bp長度的序列，與GenBank 中已報道的多株枯草芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高，序列相似性均達99.5%以上，采用 NJ 法構建基于gyrB基因序列系統發育樹（圖4），從gyrB基因序列系統發育樹分析，菌株YC2006與枯草芽孢桿菌G2菌株聚為一支，有較近的親緣關系，可信度97%，結合16S rRNA 基因的系統發育分析，將YC2006鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）;同樣的方法，菌株YC2008的gyrB基因（1 170 bp）與多株解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高，序列相似性均達99%以上，系統發育樹（圖5）表明菌株YC2008與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens，AB829604）聚為一簇，有較近的親緣關系，結合16S rRNA 基因的系統發育分析，將YC2008鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 菌株對煙草種子萌發的影響

室內種子發芽試驗結果（表3）顯示，種子經不同濃度的芽孢桿菌液浸泡處理后，YC2006 0.5%處理發芽率顯著高于對照制劑;各處理發芽勢顯著提高，表明本試驗菌劑處理可加快煙草種子的萌發進程，煙草出苗快而整齊。

2.4 菌株對煙草幼苗農藝性狀的影響

由表4可知，處理A、B、C對煙草株高有促生作用，分別比清水對照提高了188%、103%、30%;各處理間莖圍無顯著差異，最大葉面積比對照提高了101.30%、36.46%、0.84%，處理A、B地上部鮮質量分別比對照提高了85.14%、40.09%;各處理地下部鮮質量分別比對照提高了136.36%、203.03%、69.70%。

由表5可知，處理A的平均根系直徑、總根體積與對照相比差異顯著，總根長和總根表面積均顯著高于對照，與無菌清水對照相比，分別提高了41.75%和38.95%。經0.5% YC2006處理過的煙苗根長和根系表面積均高于對照，根系更為發達。

3 結論與討論

16S rDNA基因序列因其高度的保守性而被廣泛用于細菌分子鑒定，但對近緣種常常難以區分鑒別。gyrB基因存在于所有細菌中，其分子進化速率大于16S rDNA基因，且不同種細菌的gyrB基因存在較大差異，常作為用芽孢桿菌種水平鑒定的靶標基因[17]，本研究同時根據16S rDNA和gyrB序列和系統發育分析結果，將菌株YC2006和YC2008初步鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。煙草立枯病、黑脛病和赤星病是當前煙草育苗和大田生長期的主要真菌性病害，本研究對菌株抑菌活性測試發現，菌株YC2006和YC2008對供試的3種病原菌均有不同程度的抑制活性，抑制活性強度以立枯病病原最為明顯，煙草大田期靶斑病病原與立枯病病原屬同種不同融合群，推測本試驗菌株也可抑制煙草靶斑病病原，菌株抑菌譜等相關試驗有待進一步開展，以明確其抗病應用范圍。室內種子萌發試驗和溫室幼苗盆栽試驗結果顯示，高濃度的菌株對煙草種子萌發和幼苗生長有抑制現象，與楊曉云等發現高濃度解淀粉芽孢桿菌B1619發酵液對番茄種子萌發和幼苗植株生長有抑制作用結果相似，表明在實際應用中明確生防菌株濃度施用范圍十分重要，同時還需對加工工藝、劑型等下游技術開展研究，以便更好地發揮出生防菌的生防作用[18]。

微生物促進植物生長一般可歸納為：一是通過其生長繁殖及代謝活動產物，促進土壤養分合成、分解與轉化，供植物生長利用，如芽孢桿菌代謝產生生長激素等促進植物吸收水分和養分物質，直接促進植物生長[19];二是通過營養競爭、產生抑菌物質抑制有害微生物的生長，維持根系微生態平衡，減少病原菌的侵染而間接促進植物生長。吳亞勝等研究發現，在育苗基質中添加叢枝菌根真菌，菌根侵染率明顯提高，對辣椒幼苗的生長表現出顯著的促進作用[20];多黏類芽孢桿菌CF05發酵液對番茄幼苗有明顯的促生效果，鮮質量增加272.0%，干質量增加266.7%[21]。本研究在育苗基質中添加枯草芽孢桿菌YC2006、解淀粉芽孢桿菌YC2008表現出了顯著的煙苗促生活性，添加0.5% YC2006，煙苗株高、最大葉面積、地上/地下部鮮質量、總根長和總根表面積較商品化的枯草芽孢桿菌菌劑分別提高了149.44%、62.1%、60.55%、39.29%、71.60% 和 70.15%，菌株促生機理值得進一步研究。生防菌施用后，穩定的定殖能力是其發揮生防、促生作用的關鍵因素[22]，本試驗菌株為煙草根際分離所得，可能更適合在根際定殖并發揮作用，菌株YC2006和YC2008可通過拌種、基質添加等使用方式促進煙草生長，同時，菌株對煙草主要真菌病原具有明顯的抑制作用，可作為優良的菌種材料用于煙草專用微生物種衣劑、微生物菌劑和菌肥的開發。

參考文獻：

[1]朱賢朝.中國煙草病害[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

[2]Tunsagool P，Leelasuphakul W，Jaresitthikunchai J，et al. Targeted transcriptional and proteomic studies explicate specific roles of Bacillus subtilis iturin A，fengycin，and surfactin on elicitation of defensive systems in mandarin fruit during stress[J]. PLoS One，2019，14（5）：e0217202.

[3]千慧敏，趙 輝，劉新濤，等. 生防細菌PA2101和PG3402抑菌和促生特性的研究[J]. 中國生物防治學報，2020，36（1）：135-144.

[4]Wagi S，Ahmed A. Bacillus spp.：potent microfactories of bacterial IAA[J]. PeerJ，2019，7：e7258.

[5]荊卓瓊，郭致杰，徐生軍，等. 解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的篩選鑒定及其防治番茄灰霉病效果的評價[J]. 草業學報，2020，29（2）：31-41.

[6]Pandey C，Bajpai V K，Negi Y K，et al. Effect of plant growth promoting Bacillus spp. on nutritional properties of Amaranthus hypochondriacus grains[J]. Saudi Journal of Biological Sciences，2018，25（6）：1066-1071.

[7]Aydinogˇlu B，Shabani A，Safavi S M. Impact of priming on seed germination，seedling growth and gene expression in common vetch under salinity stress[J]. Cellular and Molecular Biology，2019，65（3）：18-24.

[8]侯樂梅，孟瑞青，乜蘭春，等. 不同微生物菌劑對基質酶活性和番茄產量及品質的影響[J]. 應用生態學報，2016，27（8）：2520-2526.

[9]呂偉生，黃國強，邵正英，等. 接種菌劑腐熟稻草育秧基質提高機插稻秧苗素質及產量[J]. 農業工程學報，2017，33（11）：195-202.

[10]張明宇，劉高峰，李小龍，等. 施用生物有機肥對煙草根際土壤微生物區系的影響[J]. 河南農業大學學報，2020，54（2）：317-325.

[11]Asari S，Tarkowská D，Rolcˇík J，et al. Analysis of plant growth-promoting properties of Bacillus amyloliquefaciens UCMB5113 using Arabidopsis thaliana as host plant[J]. Planta，2017，245（1）：15-30.

[12]Asari S，Matzén S，Petersen M，et al. Multiple effects of Bacillus amyloliquefaciens volatile compounds：plant growth promotion and growth inhibition of phytopathogens[J]. FEMS Microbiology Ecology，2016，92（6）：fiw070.

[13]Yamamoto S，Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（3）：1104-1109.

[14]豆雅楠，牛世全，豆建濤，等. 芽孢桿菌拮抗蘋果樹腐爛病菌的篩選、鑒定及抑菌活性初探[J]. 微生物學通報，2018，45（12）：2684-2694.

[15]國家煙草專賣局.煙草農藝性狀調查測量方法：YC/T 142—2010[S]. 北京：中國標準出版社，2010.

[16]王亞男，程立娟，周啟星.鳶尾對石油烴污染土壤的修復以及根

系代謝分析[J]. 環境科學，2016，37（4）：1531-1538.

[17]賈慧慧，謝心悅，潘園園，等. 芽胞桿菌BJ-6的鑒定及對甜瓜細菌性果斑病的防治[J]. 微生物學報，2020，60（5）：982-991.

[18]楊曉云，陳志誼，蔣盼盼，等. 解淀粉芽孢桿菌B1619對番茄的促生作用[J]. 中國生物防治學報，2016，32（3）：349-356.

[19]張榮勝，戴秀華，劉永鋒，等. 解淀粉芽孢桿菌Lx-11的促水稻生長作用及促生長物質分析[J]. 核農學報，2018，32（6）：1230-1238.

[20]吳亞勝，王其傳，祁紅英，等. 育苗基質中添加叢枝菌根真菌菌劑對辣椒幼苗生長和光合參數的影響[J]. 蔬菜，2018（7）：12-16.

[21]郭芳芳，謝 鎮，盧 鵬，等. 一株多粘類芽孢桿菌的鑒定及其生防促生效果初步測定[J]. 中國生物防治學報，2014，30（4）：489-496.

[22]Martins S J，Medeiros F，Lakshmanan V，et al. Impact of seed exudates on growth and biofilm formation of bacillus amyloliquefaciens ALB629 in common bean[J]. Frontiers in Microbiology，2017，8：2631.