果樹脫毒技術研究進展

李亞囡1，李學華1，范婧芳2，王文瑾1，董 輝1*

（1 河北省農林科學院石家莊果樹研究所 石家莊 050061；2 河北省植保植檢總站）

果樹病毒脫毒就是利用一定的技術手段從現有的栽培種質資源中篩選出不帶病毒的單株，或利用一定的方法和技術去除植株體內的病毒，從而獲得無病毒的果樹苗木[1]。目前已報道的脫毒效率較高的技術有：熱處理脫毒法、莖尖培養脫毒法、微體嫁接脫毒法、熱處理結合莖尖培養脫病毒法及應用病毒抑制劑的化學處理脫毒技術等[2，3]。

1 熱處理脫毒技術

熱處理脫毒技術是最早研究并應用在果樹脫毒處理中的方法之一，并且被普遍使用在果樹脫毒中[4]。基本原理是根據病毒和寄主細胞對高溫的耐受性存在差異，利用高溫處理殺滅或延緩病毒繁殖，抑制病毒在果樹組織內的侵染，進而脫除病毒培育出無毒果樹[5]，同時對寄主細胞影響較小。該方法工藝簡單，對設備要求低，能在較短時間內清除病毒獲得無毒植株。在熱處理時，需綜合考慮不同果樹品種的熱耐受性以及抑制不同類型病毒復制侵染所需的溫度[6，7]，避免在熱處理過程中對果樹苗木生長造成傷害。以梨樹脫毒技術為例，梨樹苗在37 ℃環境中處理28 d，可有效脫除矮化病毒、環斑花葉病毒和梨脈黃病毒，但梨樹苗木在此過程中也會有高達66%以上的死亡率[8]。此外，該技術對某些種類病毒（如桿狀病毒）無效，并且存在脫毒率低、脫毒不徹底等問題，因此該技術在實際生產應用方面有待進一步優化和針對性研究[9]。

2 莖尖培養脫毒技術

病毒在被侵染植物體中的分布不均勻，通常在植株生長點附近的組織中無病毒存在或病毒的含量較低[10]。因此可借助植物組織培養技術，利用果樹植株幼嫩組織部分或分生組織為材料進行培養從而得到無毒材料，獲得完整的脫毒植株。

由于不同品種果樹生長周期及其莖尖分生組織的形態大小各不相同，因此不同果樹的莖尖分生組織的獲取難度也不同[4，11]。此外，莖尖組織的大小與脫毒率、組織培養成活率直接相關。一般切取的莖尖越小，脫毒的效率越高。例如，利用莖尖培養脫毒技術獲得草莓脫毒苗的培養過程中，切取0.1～0.2 mm的莖尖分生組織時，脫毒率為100%；切取0.3～0.4 mm 的莖尖分生組織時，脫毒率為84.5%[1]。但切取0.1～0.2 mm的莖尖分生組織對技術要求極高，即使成功切取分生組織，其分化率和成活率均不高。因此，在進行莖尖培養脫毒時需綜合考慮果樹品種、脫毒率以及成活率等多方面問題。進一步研究表明，在兼顧成活率和脫毒率的條件下，切取長度為0.2～0.5 mm、帶有1～2 個葉原基的莖尖進行莖尖培養脫毒效果比較好[2，6]。

3 熱處理與莖尖培養結合脫毒技術

在實際操作中，使用一種脫毒方式往往無法完全脫除病毒，且操作難度大、處理條件要求較高。研究證明，熱處理脫毒技術和莖尖培養技術相結合可有效提高脫毒效率[6]，并且還能在一定程度上降低操作難度。以蘋果苗木為例，在使用這種復合脫毒技術后，能高效脫除蘋果莖溝病毒，其脫毒率高達90%以上[12]。

熱處理與莖尖培養結合脫毒的方法主要分為兩種[1]：一種是將果樹材料先熱處理操作，再從處理后的植株上獲得莖尖分生組織培養為脫毒植株；另一種是先取相對較大的莖尖分生組織培養，然后對獲得的植株進行熱處理操作，再取莖尖進行再次分生培養。

4 微體嫁接脫毒技術

微體嫁接脫毒技術是結合組織培養與嫁接技術獲得無毒植株的一種新技術[13，14]，切取0.1～0.2 mm 的莖尖材料為接穗，嫁接到試管培養的無毒砧木上，從而培養成為完整的植株。該技術還可有效解決莖尖培養中培養材料誘導生根難的問題。Navarro 等[2]在柑橘植株脫除病毒的研究中應用此技術，植株脫毒率可達80%以上，目前該技術已推廣到其它果樹品種。

5 化學處理脫毒技術

近年來隨著果樹脫毒技術研究的不斷深入，一些對植物病毒復制、侵染、擴散有一定抑制作用的化學物質被不斷發現[15，16]，如抗病毒醚（Ribavirin）、DHT（2，4-dioxohexa-hydro-1，3，5-triazine）等化合物均對植物DNA 或RNA 病毒具有抑制作用[17]。雖然這類物質不能脫除所有病毒，但在莖尖組織培養和原生質體培養過程中加入此類化學物質，能抑制病毒復制[18]，具有一定實用價值。目前，此類化合物對病毒抑制的作用機制和實際應用技術的研究還較為局限，未來需研發出能夠應用于實際生產的抗病毒制劑。

6 培育抗病毒植物

Beachy 等[20]借助基因工程技術成功將煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白基因轉入煙草中，獲得了抗TMV 的煙草，自此以后，通過轉入病毒基因而培育出不同程度抗病毒侵染植物的技術多有報道[2]。通過進一步研究整理發現，目前針對果樹病毒應用的轉基因技術主要有3 種：1）外殼蛋白基因策略。外殼蛋白介導的抗病毒機制目前還不明確，已提出的假說認為外殼蛋白的合成和積累會影響侵染病毒的脫外殼作用和復制[19]，從而達到抵抗病毒的作用。在果樹上用此方法抵御的病毒有李痘病毒（PPV）、葡萄鉻黃花葉病毒（GCMV）、葡萄扇葉病毒（GFLV）、葡萄病毒A（GVA）等[6]。2）病毒衛星RNA 基因策略。Ponz 等[1]研究表明，煙草環斑病毒（CLRV）的衛星RNA可抑制CLRV 的復制并減輕CLRV 侵染產生的癥狀。3）病毒運動蛋白基因策略。病毒在宿主體內長距離移動需要運動蛋白的作用，此策略通過影響運動蛋白合成，限制病毒的系統性移動，從而抑制病毒的擴散。

7 展望

果樹病毒穩定性差極易產生變異，隨著果樹種植面積的不斷擴大、果樹新品種的不斷引進、果樹病毒的傳播速度呈加快態勢，給果樹病毒檢測和脫毒工作帶來了更大的挑戰。因而，對于果樹脫毒技術和病毒防治的研究也逐漸受到重視。目前，我國己建立了針對危害性較大的主要果樹病毒的檢測與脫毒技術，但部分脫毒作用的機理還有待進一步研究，現有脫毒技術還有待進一步的改進和完善。此外，我國果樹脫毒種苗規模化生產的發展還受到脫毒效率低、種質資源匱乏等因素的制約，因此仍需進一步通過現代生物技術手段提高果樹脫毒效率，縮短脫毒周期。