蘋果半矮化砧木G.935的離體快繁體系建立

孫清榮，關(guān)秋竹，何平，李林光，王海波，陶吉寒，孫洪雁

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

果樹繁殖主要是通過把優(yōu)良品種的接穗嫁接到適宜砧木上進(jìn)行的，這種繁殖方式一方面保證了無性繁殖品種的穩(wěn)定性，另一方面又可利用砧木的優(yōu)良特性對(duì)接穗品種進(jìn)行改良，提高其抗逆性、抗病蟲能力及早實(shí)性，改善樹體大小等［1-3］。另外，砧木還可影響接穗品種的基因表達(dá)模式［4］及抗或耐重茬性［5］。因此，在果樹栽培生產(chǎn)上，砧木發(fā)揮著與品種同等重要的作用。而矮化砧木的育成與應(yīng)用對(duì)現(xiàn)代化商業(yè)化果園的生產(chǎn)更有其特殊意義。矮化砧木可控制上部接穗品種樹體的長(zhǎng)勢(shì)，使樹體矮化，便于果園機(jī)械化管理；矮化還可加大種植密度，提高光能利用率和單產(chǎn)，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。因此世界各國(guó)都非常重視矮化砧木的選育，不斷有新品種育成。

蘋果砧木G.935是美國(guó)康乃爾大學(xué)紐約Geneva實(shí)驗(yàn)站從Ottawa 3（抗冠腐和根腐病資源）×Robusta 5（抗火疫病資源）雜交種中選育出的半矮化砧木，具有高抗火疫病、耐重茬、高抗根腐病、耐寒等優(yōu)良特性，生產(chǎn)效率相當(dāng)于矮化砧木M9。現(xiàn)已引入我國(guó)，但尚處于試驗(yàn)觀察階段，還沒有在生產(chǎn)上大規(guī)模推廣應(yīng)用。建立其離體快繁體系以快速獲得優(yōu)質(zhì)種苗，可為其今后在栽培生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，從而加速優(yōu)良砧木推廣。目前有關(guān)蘋果半矮化砧木G.935組培快繁的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以G.935當(dāng)年生新梢芽段為外植體獲得無菌苗，然后以無菌苗為試材，設(shè)置不同的基本培養(yǎng)基和激素種類及濃度，對(duì)其增殖和生根培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以建立其高效離體快繁技術(shù)體系，為今后推廣應(yīng)用及提供優(yōu)良矮化砧木種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山東省果樹研究所天平湖試驗(yàn)基地嫁接種植的蘋果半矮化砧木G.935小樹。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試管苗建立 2016年4月中旬，剪取當(dāng)年新生的半木質(zhì)化枝條，去掉葉片帶回實(shí)驗(yàn)室；把枝條剪成一芽一段的芽段，參照孫清榮等［6］的方法進(jìn)行消毒，然后接種到裝有腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基的試管內(nèi)，一管一個(gè)芽段，并置培養(yǎng)室誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)至伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成無菌綠苗。腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-芐基氨基嘌呤（6-BA）+0.1 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）+0.3 mg·L-1赤霉素（GA3）。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) 以無菌綠苗作為繼代增殖的材料，設(shè)置4種培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖：①M(fèi)S+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA；②MS+1.0 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA；③NM+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA；④NM+1.0mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA。每一個(gè)繼代增殖周期為4周，統(tǒng)計(jì)每一個(gè)周期的試管苗增殖倍數(shù)，以繼代培養(yǎng)3個(gè)周期的增殖倍數(shù)的平均值作為每一處理的增殖倍數(shù)，重復(fù)2次。

1.2.3 生根培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) 以繼代增殖并伸長(zhǎng)至1 cm以上的健壯綠梢為試材，設(shè)置不同培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基選用1/2MS和1/4MS，激素選用IBA和吲哚乙酸（IAA）并各設(shè)兩個(gè)濃度，前者為0.2、0.4 mg·L-1，后者為0.5、1.0 mg·L-1，共構(gòu)成8個(gè)處理。每個(gè)處理接種3瓶，每瓶種植10個(gè)綠梢，共計(jì)30個(gè)綠梢，作為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。接種后置于連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)光培養(yǎng)4周，統(tǒng)計(jì)生根梢數(shù)和單株生根數(shù)，計(jì)算生根率和平均每株生根數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用DPSv3.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用最小顯著差異（LSD）法進(jìn)行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 試管苗的建立

半木質(zhì)化芽段在腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后萌發(fā)形成可用于繼代繁殖的無菌試管綠苗（圖1 A），腋芽萌發(fā)率在80%以上，表明所選啟動(dòng)培養(yǎng)基對(duì)蘋果砧木G.935腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)是有效的。

2.2 試管苗增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

四種培養(yǎng)基都能促進(jìn)試管苗增殖，平均一個(gè)繼代周期的增殖倍數(shù)都達(dá)到了4以上，不同培養(yǎng)基間差異不顯著（表1）。但以MS為基本培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)略高于以NM為基本培養(yǎng)基的。增殖苗在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)不同：當(dāng)添加0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA時(shí)，MS培養(yǎng)基上產(chǎn)生有明顯節(jié)間伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的綠苗（圖1 B），而NM培養(yǎng)基上的增殖苗增高生長(zhǎng)較差，沒有明顯的節(jié)間伸長(zhǎng)（圖1 D）；當(dāng)添加1.0 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA時(shí)，MS培養(yǎng)基上的增殖苗雖有節(jié)間伸長(zhǎng)，但葉片卷曲不伸展，而且有玻璃化現(xiàn)象發(fā)生（圖1 C），而NM培養(yǎng)基上的增殖苗節(jié)間伸長(zhǎng)，葉片較伸展，沒有玻璃化現(xiàn)象發(fā)生，但葉色較淺（圖1 E）。表明，當(dāng)BA和IBA濃度較低時(shí)，基本培養(yǎng)基MS更有利于增殖培養(yǎng)；但當(dāng)BA和IBA濃度較高時(shí)，使用基本培養(yǎng)基NM更有利于獲得正常生長(zhǎng)的增殖苗。綜合來看，以MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA進(jìn)行增殖培養(yǎng)的效果最好。

表1 蘋果半矮化砧木G.935試管苗增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

圖1 G.935試管苗建立及在不同增殖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)

2.3 試管苗生根培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)試管苗生根率和單株生根數(shù)的影響 兩種基本培養(yǎng)基上均以添加IBA的生根率和單株生根數(shù)較高，顯著高于添加IAA的；基本培養(yǎng)基相同時(shí)，添加0.2 mg·L-1IBA的生根率和單株生根數(shù)高于0.5 mg·L-1IBA，在1/2MS上差異不顯著，在1/4MS上差異達(dá)顯著水平；IBA添加濃度相同時(shí)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基的生根率和單株生根數(shù)均高于以1/4MS為基本培養(yǎng)基的，其中，生根率在添加0.5 mg·L-1IBA時(shí)差異達(dá)顯著水平，單株生根數(shù)在兩種濃度IBA下均差異顯著（表2）。

表2 不同培養(yǎng)基上蘋果砧木G.935試管苗的生根率和單株生根數(shù)

2.3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)生根進(jìn)程和途徑的影響培養(yǎng)至第14天就可以觀察到明顯的小短根產(chǎn)生（圖2 A～D），添加IBA培養(yǎng)基上的根（圖2 A和C）比添加IAA上的根（圖2 B和D）稍短，但單株根數(shù)較多。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在添加IBA的培養(yǎng)基上既有根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)又有單株根數(shù)的增加（圖2 E和F），而在添加IAA處理的培養(yǎng)基上僅有根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，根數(shù)不再增加（圖2 G和H）。

在添加IBA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的愈傷（圖2 A、C、E、F），推測(cè)IBA可能是先誘導(dǎo)出愈傷，再由愈傷產(chǎn)生根；而在添加IAA的培養(yǎng)基上根是從莖切面直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的，不通過愈傷階段（圖2 B、D、G、H），所以其誘導(dǎo)生根進(jìn)程更快，第14天時(shí)的根明顯長(zhǎng)。

圖2 不同生根培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

綜合上述分析，適宜蘋果半矮化砧木G.935的生根培養(yǎng)基為添加0.2 mg·L-1IBA的1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基，尤以1/2MS+0.2 mg·L-1IBA最佳。

3 討論與結(jié)論

植物試管苗增殖快繁的成敗取決于培養(yǎng)基的組成，其中，基本培養(yǎng)基組分和外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是主要的影響因素［7］，在蘋果砧木上的研究已有較多報(bào)道，但不同品種適宜的基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)不同［8-16］。如適宜砧木54-118、JM7、GM256、Budagovsky71-3-150、Budagovsky60-160增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為QL［10-12］；適宜砧木G.41的增殖培養(yǎng)基為同時(shí)添加1 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1TDZ的MS培養(yǎng)基，若單加BA則增殖率很低，若單加TDZ雖增殖率較高，但產(chǎn)生畸形葉和玻璃化苗［13］。本研究選用的試材砧木G.935與G.41的親本之一都有‘Robusta5’，但適宜兩者試管苗增殖的培養(yǎng)基不同，本試驗(yàn)中適宜G.935增殖的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA。因此，蘋果砧木試管苗的增殖快繁應(yīng)針對(duì)不同品種選用其適宜的增殖培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)是離體快繁中關(guān)鍵的一步，直接影響工廠化繁育試管苗的成敗。本試驗(yàn)選用的G.935是一個(gè)生根相對(duì)較易的品種，在1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基中添加適宜濃度的IBA或IAA都能成功誘導(dǎo)試管苗生根，但以添加0.2 mg·L-1IBA的效果更好，生根率可達(dá)90%以上，單株生根6條以上，其中以1/2MS為基本培養(yǎng)基的效果好于1/4MS，這與孫清榮等［17］報(bào)道的BP-176砧木在1/2MS上的生根效果好于1/4MS一致。王淑華等［18］研究表明在‘嘎啦’蘋果試管苗生根培養(yǎng)時(shí)IAA表現(xiàn)優(yōu)于IBA和NAA；而吳玉霞等［19］在‘粉紅佳人’試管苗生根培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)IBA比IAA明顯提高生根率。不同品種對(duì)IAA的生根反應(yīng)不同可能與不同品種梢基部的游離IAA水平不同有關(guān)。Alvarez等研究表明，相比M9，IAA誘導(dǎo)M26的生根率更高，其原因是M26比M9的梢基部含有更高水平的游離IAA［20］。

本研究建立了蘋果優(yōu)良半矮化砧木G.935的高效離體快繁技術(shù)體系：以當(dāng)年新生的半木質(zhì)化枝條為材料，以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1GA3作為腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基，獲得無菌試管苗；再以試管苗為試材，用MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA進(jìn)行增殖培養(yǎng)，用1/2MS+0.2 mg·L-1IBA進(jìn)行生根培養(yǎng)，短時(shí)間內(nèi)可獲得規(guī)模無性繁殖的健康幼苗。這為今后推廣應(yīng)用半矮化砧木G.935奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。