蛋白質組學在番茄非生物逆境脅迫中的研究進展

王 強，王柏柯，劉會芳，韓宏偉，莊紅梅，王 娟，楊 濤，

王 浩1，秦 勇2

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091，2.新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】番茄(Solanumlycopersicum)屬于茄科植物，番茄是溫帶作物，在不同的氣候區都可種植，大多數非適宜番茄種植區采用溫室栽培，不斷變化的環境條件和非生物逆境脅迫，如干旱、鹽堿、高溫等，影響了番茄作物的生產力和產量。隨著現代生物技術的迭代發展，產生了基因組學，轉錄組學，蛋白質組學，代謝組學等組學分支[1-3]。組學方法從有機體、組織、細胞乃至分子，提供了宏觀到微觀的整體視圖。通過一個相對較新的生命科學分支，來提供多維生物學信息的不同組學[4-5]。另外，環境干擾的復雜性和變化性迫切需要系統生物學方法來描述基因、蛋白質和代謝產物，以正確評估由相應應激條件引起的定性和定量變化及影響。轉錄水平的變化并不總是反映蛋白質水平的變化，這主要歸因于轉錄產物的降解和轉錄后的調控機制[1]。與基因組學和轉錄組學相比，其他組學分支如蛋白質組學、代謝組學尚未得到充分探索。已有的基因組/轉錄組學分析雖然為揭示植物響應逆境脅迫調控機制提供了一些重要信息[6-9]。但由于植物對脅迫的反應是一個復雜的過程，如涉及代謝產物的積累或蛋白質表達的翻譯水平修飾，都無法通過轉錄組學或基因組方法進行研究[10]。其次由于存在轉錄可變剪切、蛋白質翻譯后修飾、蛋白質相互作用、蛋白質亞細胞定位，以及基因/蛋白質的多途徑調控網絡；通過單基因策略和轉錄組研究并不能全面揭示植物體內應對逆境脅迫的機理機制，如蛋白質合成后的修飾加工、定位、蛋白質與蛋白質間的分子互作、蛋白質分子與其他生物分子間的相互作用等活動，這些都無法在基因組/轉錄組水平上獲知。在蛋白質組水平研究響應非生物逆境脅迫機制非常必要[11-14]。【前人研究進展】近20年來，隨著基于凝膠和無凝膠蛋白分離及相對定量技術(2D-DIGE，iTRAQ，無標記質譜/質譜蛋白定量)的發展和模型植物(擬南芥、番茄)以及主要作物(水稻，大豆，玉米，大麥，小麥)全基因組序列的發表，植物高通量蛋白質組學研究呈現出蓬勃發展的趨勢。近年來發表的關于植物脅迫蛋白質組學的綜述論文，包括植物非生物脅迫蛋白質組學綜述[15]，鹽、干旱和極端溫度等主要非生物脅迫蛋白質組學綜述[16]，低溫脅迫蛋白質組學綜述[17]，脫水脅迫[18]。此外，還發表了非生物脅迫下的葉綠體蛋白質組[19]、植物蛋白質組對鹽的響應[20-21]。蛋白質組學在植物中的研究多集中在主要作物的脅迫反應[22]，包括水稻[23]、玉米[24]、小麥和大麥[25]，大豆[26]等溫帶氣候下作物的逆境蛋白質組學[27]等；蔬菜作物也有一些綜述報道[28]。【本研究切入點】非生物逆境脅迫是制約番茄作物生長發育、影響品質和產量的關鍵因素，非生物逆境脅迫是制約番茄作物生長發育、影響品質和產量的關鍵因素，關于蛋白質組在番茄作物中的研究報道逐年增多，蛋白質組技術本身也在不斷改進。回顧近年來蛋白質組在番茄非生物逆境脅迫中的研究進展。【擬解決的關鍵問題】查閱國內外相關文獻資料，收集與番茄作物相關的蛋白質組非生物逆境脅迫前沿研究報道。整理匯總，總結近年來蛋白質組學在番茄非生物逆境脅迫中的研究，為蛋白質組在番茄非生物逆境脅迫領域的研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

采集國內外相關文獻資料，收集與番茄作物相關的蛋白質組非生物逆境脅迫文獻進展。

1.2 方 法

運用統計學方法匯總文獻資料、官網數據等，總結分析蛋白質組學在番茄逆境脅迫的研究文獻，概述其在番茄非生物逆境脅迫適應機制的研究進展。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫響應

研究表明，大量的遺傳性狀已被證明與這些機制有關[29]。Chen等[30]發現了一種未知的番茄鹽反應蛋白在少于4 d的脅迫下的瞬時合成。他們還證明了脫落酸在大多數這些蛋白質的合成中并不起主要作用。Amini等[31]鑒定出5種受24 h鹽脅迫調控的番茄蛋白，而Chen等[32]在7 d鹽脅迫處理后鑒定出23種鹽脅迫響應蛋白，比較了敏感和耐受基因型。部分抗氧化蛋白、熱休克蛋白和碳水化合物代謝相關蛋白表達上調。Juan等[33]觀察到與敏感品種相比較，耐鹽番茄品種的蔗糖水平提高，相反，核糖-1,5-雙磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)活性水平更低，總的RuBisCO活性得到抑制，CO2的吸收減少。Manaa等[34]證明了在鹽脅迫條件下2個不同品種番茄的生理和分子的變化。植物受到脅迫表現出生長和葉片滲透勢降低，而脂質過氧化(丙二醛含量)則升高。而與先前的研究相反的是RuBisCO活酶以及與光合作用相關的蛋白質RuBisCO大亞基，丙酮酸脫氫酶，葡萄糖6-磷酸脫氫酶，蘋果酸脫氫酶在鹽脅迫條件表達水平上升。Amini等[35]研究了鹽誘導的番茄蛋白質組變化，在添加0、40、120和160 mM的氯化鈉營養液的幼苗處理24 d，雙向電泳蛋白質組學方法檢測到400個蛋白點，其中18個蛋白點在鹽脅迫下表現出顯著變化。值得關注的是，表皮生長因子受體蛋白(EGFR)，酪氨酸激酶超家族的成員在鹽脅迫條件下表達水平增加，這也是已知的磷酸化信號轉導事件的前體。過氧化氫(H2O2)也誘導表皮生長因子受體磷酸化。在鹽脅迫下，活性氧(ROS)包括H2O2作為代謝的副產物形成，因此，應激蛋白EGFR的上調也可能與H2O2的解毒作用有關。M2D3.3、RAV樣B結構域DNA結合蛋白和耐鹽蛋白(分子量25 kDa)也在鹽脅迫條件下大量增加。番茄品種Moneymaker幼苗在不同濃度氯化鈉(50、100和150 mM)下鹽脅迫處理，并進行雙向差異凝膠電泳技術，結果鑒定出17個包括鐵氧還蛋白(+)還原酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的差異蛋白，其中鐵氧還蛋白(+)還原酶在鹽脅迫下被誘導1.2倍，這是因為植物葉綠體硫氧還蛋白系統使用鐵氧還蛋白還原酶來解毒過氧化物酶以維持細胞穩態[36]。還鑒定到了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，它是蔗糖[37]、細胞壁多糖[38]和淀粉生物合成[39]的重要前體。

鹽脅迫下，對番茄幼苗(Patio和F144)采用雙向電泳結合液質聯用技術分析了自由基和下胚軸的蛋白質組，檢測到23種蛋白質，包括熱休克蛋白、解毒酶、碳水化合物代謝、ATP合成酶、轉錄翻譯和光合代謝[40]。此外，還評估了甜菜堿對鹽脅迫誘導的外源性作用，這與已知的鹽脅迫條件下的反向抑制作用類似[40]。蛋白質組學分析在2個品種中鑒定出了不同的候選蛋白，這些蛋白主要參與細胞挽救及防御[40]。Gong等[41]利用iTRAQ技術，鑒定了一組番茄根系對NaCl和NaHCO3脅迫的差異表達蛋白，共觀察到313個對NaCl和NaHCO3反應的蛋白。其中，鹽脅迫上調蛋白70個，堿脅迫上調蛋白114個，鹽處理下調蛋白80個，堿處理下調蛋白83個。只有39個上調蛋白和30個下調蛋白被鹽脅迫和堿脅迫共同存在。與鹽脅迫相比，堿脅迫下調了番茄根系呼吸代謝、脂肪酸氧化代謝和氮代謝相關蛋白，上調了活性氧清除和離子轉運相關蛋白。

Manaa等[42]報道了鹽和鈣對2種番茄基因型果實蛋白質組差異的影響。用對照溶液(3 dSm-1)或含鹽溶液(7.6 dSm-1的鈉/鈣鈉)灌溉番茄植株。在番茄果實綠色(開花后14 d)和轉紅2個階段，通過雙向凝膠電泳進行分離。在檢測到的600個蛋白質點中，53個點在樣品之間顯示出顯著的差異。大多數已鑒定的蛋白質參與碳和能量代謝、鹽脅迫、氧化脅迫以及與成熟過程相關的蛋白質。2種基因型之間的蛋白質豐度有很大的差異，這可能與鹽處理或/和果實成熟期有關。鈣具有保護作用，限制了鹽堿化對代謝、成熟過程的影響，并誘導植物耐鹽，揭示了NaCl (Na或Ca2++Na)脅迫下番茄果實蛋白質組水平的變化，并根據蛋白質的功能及其對鹽脅迫反應的響應將其與果實發育階段聯系起來。

Tang等[43]采用蛋白質組學和代謝組學方法，研究了不同成熟階段番茄果實蛋白質和代謝產物的變化以及鹽處理對果實品質的影響，成熟青果和NaCl處理的成熟果分別與成熟果相比差異蛋白有2 607和153個差異蛋白。重要的是，NaCl處理誘導了β-果糖呋喃糖苷酶和脂氧合酶的蛋白表達，這2種酶分別負責糖和揮發性芳香物質的積累。NaCl處理增加了氨基酸丙氨酸的積累和支鏈氨基酸轉氨酶的表達，支鏈氨基酸轉氨酶是參與酯催化合成的關鍵酶。NaCl處理抑制了β-半乳糖苷酶和內切葡聚糖酶的表達，提高了果實的硬度。

2.2 干旱脅迫響應

Ogden等[44]收集了干旱脅迫和恢復期番茄葉片韌皮部分泌物，分析鑒定了2 558個蛋白質，在韌皮部汁液中發現了大量已知和新發現的蛋白，以及在干旱條件下其豐度發生變化的蛋白質。新發現的韌皮部汁液蛋白包括活性氧、海藻糖代謝以及RNA沉默相關的蛋白。

Tamburino等[45]研究了番茄葉綠體對嚴重干旱處理的反應和隨后的恢復周期。水分虧缺嚴重影響葉綠體蛋白質組成，主要涉及與能量相關的功能蛋白。在恢復水分循環之后，生理參數和代謝水平表明番茄植物功能恢復，而蛋白質組學顯示葉綠體蛋白組成仍在進行調整，其范圍甚至比干旱時期還要廣泛。候選基因表達和脫落酸積累的變化表明，在特定的葉綠體-細胞核(逆行)信號轉導通路的應答作用下激活并與脫落酸依賴的網絡互連。通過協調核編碼質體定位蛋白的表達和介導植物逆境響應，對葉綠體作為環境傳感器的作用進行了概述。

Zhou等[46]利用敏感番茄品種(LA3465)和耐脫水番茄品種(LA1958)根系蛋白質組的比較分析，鑒定到蛋白質在耐受機制中起重要作用。LA1958品種鑒定到170種蛋白質，其中106種蛋白質在脅迫條件下被抑制，64種蛋白質被誘導。同樣，在番茄中LA3465中，在130個鑒定的蛋白質中，104個蛋白質在脅迫條件下被抑制，26個蛋白質被顯著誘導。在LA1958中，誘導了晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)和脫落酸(ABA)、脅迫和成熟誘導(ASR)蛋白。在LA3465中誘導出脫水蛋白和水分脅迫誘導蛋白3。此外，鈣調素在耐受番茄品種中被誘導，但在敏感品種中被抑制。在這2個品種中，用于折疊新生和變性蛋白以及在內質網和線粒體細胞器中介導蛋白質加工和定位的蛋白質受到不同的影響。Marjanovic等[47]研究了部分根區干旱(PRD)對番茄果實的影響。從果實2個生長階段(開花后15和30 d)的果皮組織中提取蛋白質，進行蛋白質組學分析，PRD果實的細胞壁、能量和應激防御相關蛋白的表達增加可以延長果實的生長時間，在PRD果實細胞擴張階段，一些抗氧化酶的上調可能與其保護果實免受PRD誘導的輕度脅迫有關。

2.3 高溫脅迫響應

番茄植株的生長和發育對持續或短暫高溫非常敏感，高溫可能導致產量急劇下降[48]。超過閾值水平的高溫會對植物的生長、光合作用和產量造成不可逆轉的損害[49]。嚴重的高溫脅迫會給農作物造成永久性損害[50]。溫度超過35℃會對花朵的發育過程產生負面影響，而花藥是最易感的生殖器官[51-53]。高溫的各種影響也取決于基因型(即耐熱性或熱敏性品種)。Chaturvedi等[54]使用鳥槍蛋白質組學方法(GEL-LTQ-Orbitrap MS)比較了番茄Hazera 3017中2個花粉發育階段(減數分裂后和成熟)的熱應激蛋白質組。Hazera 3017是1種對熱敏感的品種，共鑒定出2 000個蛋白。在這項研究中，通過應用1種新的tMAPA策略對鑒定的肽進行定量，從而檢測出51種獨特的蛋白作為熱響應候選物。在減數分裂后期，鑒定出晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)、冷休克蛋白1、小熱休克蛋白20(sHSP20)和22個伴侶蛋白之類的蛋白。LEA是熱應激的重要蛋白質標記，它參與蛋白質的正確折疊和構象(結構和功能)，LEA蛋白在應激條件下在所有發育階段均表達，無組織特異性。此外，已知sHSP20和22在熱處理減數分裂后期(小孢子和極化小孢子)起保護作用。番茄的轉錄分析表明編碼熱應激轉錄因子，熱休克蛋白以及參與ROS清除劑過程的蛋白參與了生殖組織對熱脅迫和耐熱性的響應[55-57]。Mazzeo MF等[58]從2種基因型(耐熱和熱敏感)收集的番茄花藥進行了差異蛋白質組學研究，探索脅迫響應機制并鑒定可能與耐熱相關的蛋白質。結果表明，熱脅迫主要影響能量和氨基酸代謝以及氮同化作用，并調節蛋白質的表達，從而保證蛋白質質量和ROS解毒。此外，鑒定了與耐熱特性潛在相關的蛋白質，例如谷氨酰胺合成酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶和多酚氧化酶。

Zhou等[59]比較了3個番茄品種Walter LA3465(耐熱)、Edkawi LA2711(中度耐熱)、LA1310(熱敏感)的蛋白質組。在研究中，對具有4片完全展開的葉片的幼苗進行7 d的熱處理(39℃/25℃，16/8光暗周期)。結果在熱脅迫下，品種Walter LA3465的牻牛兒牻牛兒還原酶、鐵氧還蛋白-NADP(+)還原酶、RuBisCO活化酶、轉酮酶被抑制，而胞質NADPmalic酶和超氧化物歧化酶被誘導。另一方面，在栽培品種Edkawi LA2711中，9種蛋白質(RuBisCO活化酶、黃酮醇合酶、M1家族肽酶等)被抑制，而包括親環素、果糖1，6-二磷酸醛縮酶、轉酮酶等在內的一些其他蛋白質被增加。在LA1310品種中，8種蛋白質被熱抑制，4種被熱誘導。結合從3個番茄品種的蛋白質組分析中獲得的信息表明，在熱脅迫下，像RuBisCO活化酶和S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶這樣的蛋白質以及一些其他參與細胞防御、碳水化合物代謝、光合作用(例如轉酮酶)的蛋白質受到抑制。Muneer S等[60]以“Super Sunload”和“Super Doterang”為接穗，以“B-blocking”為砧木在不同溫度下生長的番茄植物的生理和蛋白質組學分析。共鑒定出87種對不同溫度有反應的蛋白質。

2.4 低溫/冷脅迫響應

低溫(<20℃)或冷害(<0℃)的溫度會影響植物的生長和存活，而這些條件由于組織中結冰會導致細胞脫水[61]。在這種不利條件下，植物通常會通過激活初級代謝并增加抗氧化劑和伴侶蛋白的水平來產生更多的能量。前期研究使用2-DE[62]和2D-DIGE[63]分析了低溫對番茄果實的影響。低溫處理的番茄果實的2-DE分析表明，在低溫脅迫下蛋白質組的調節率為6%。特別是硫氧還蛋白過氧化物酶和富含甘氨酸的RNA結合蛋白(GRP)與番茄果實的低溫脅迫有關[62]。另一方面，2D-DIGE對低溫處理的番茄果實的分析表明，與防御相關的蛋白質，如sHSP和晚期胚胎發生蛋白。以及與光合作用和蛋白質降解機制解偶聯有關的蛋白質。此外，觀察到ATP合酶，26S蛋白酶體亞基RPN11和天冬氨酸蛋白酶豐度降低是對番茄果實冷脅迫的早期反應[63]。

Page等[64]研究表明，冷藏水果中上調的蛋白質與抗凍性有關，而下調的蛋白質則與冷凍過程有關。參與對低溫條件的不同抗性的蛋白質是小熱休克蛋白(sHSPs)和一組參與防御內質網應激脅迫的蛋白質。Vega-Garcia等[65]比較了低溫貯藏的番茄和室溫貯藏番茄的蛋白質譜。觀察到2種與冷害有關的蛋白質硫氧還蛋白過氧化物酶和富含甘氨酸的RNA結合蛋白積累顯著增加，在這2個蛋白質組學研究中，都比較了具有明顯冷害癥狀的正常水果和受損水果的蛋白質譜，參與植物應對冷脅迫的響應機制的蛋白質無法區分。在第1個明顯的冷害癥狀出現之前，對低溫貯藏的番茄進行蛋白質組學研究，這一策略可以避免低溫脅迫晚期相關蛋白的干擾。

2.5 其他非生物脅迫響應

Hattrup等[66]研究了番茄(Better boy)葉片在避光反應中的蛋白質組模式。在這項研究中，植物在室溫下和遮陰環境下光照直射生長。用2-DE和nESI-LC-MS/MS對葉片蛋白進行研究。共鑒定出59個差異表達的蛋白，這是避光機制的一部分。這些已鑒定的蛋白被分呼吸作用、卡爾文循環、糖酵解、生物合成、細胞維持、應激反應、呼吸作用、光收集、細胞維持、應激反應等功能類別[66]。Ahsan等[67]對番茄葉片漬水脅迫的反應。從葉片中提取總蛋白，進行聚乙二醇分餾和雙向電泳分析。聚乙二醇分餾的功效表現在葉片樣品中茜草素的耗竭和低豐度蛋白質的富集[68]。漬水脅迫在番茄葉片中產生大量的活性氧。還抑制蛋白質生物合成和蛋白酶活性，蛋白酶活性在程序性細胞死亡中起主要作用，這可能是淹水脅迫下葉片衰老的一個可能原因[67]。

3 討 論

番茄逆境脅迫處理的蛋白質組學研究仍以總蛋白質組的比較研究為主，即比較對照與脅迫處理的蛋白質組以及對特定脅迫反應不同的基因型。蛋白質組學方法通常利用二維凝膠電泳、同位素編碼親和標簽(ICAT)、同位素標記相對和絕對定量(isobaric tag for relative and absolute quantification ，iTRAQ)、質譜(MS)、基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI TOF)、蛋白質印跡等結合生物信息學工具來鑒定蛋白質并繪制它們在細胞環境中的相互作用。蛋白質組學用于鑒定番茄鹽脅迫[69]，溫度脅迫[70]和干旱脅迫[71]有關的響應蛋白。逆境脅迫相關的蛋白質已被廣泛報道，例如，利用雙向凝膠電泳和MALDI-TOF / TOF MS，番茄幼苗中發現67種差異表達的蛋白質可響應高溫[72]。在這項研究中，蛋白質組學分析低溫脅迫下番茄品種的變化[73]，除了提取、分離和檢測相關問題外，對被注釋基因的高度準確和廣泛的注釋和高質量的GO分類仍然不足。盡管已經進行了許多蛋白質組學分析來研究番茄的非生物脅迫響應，但數據分析和解釋仍然是蛋白質組學深入研究瓶頸。隨著4D蛋白質組學(4D-Proteomics)的發展，最新的DIA技術(DIA-PASEF)賦予其4D蛋白質組學數據的采集和匹配能力，相比傳統DIA技術數據匹配的缺失值和假陽性有效降低了，蛋白定量的準確度也更高，更有利于高通量的樣本采集[74]。基于MS的方法與計算工具相結合能夠同時處理數百個肽段躍遷，并具有良好的重現性、可預測性和準確性。無標簽定量程序方便，且為蛋白表達全貌研究提供可靠的數據，該方法已被廣泛應用于番茄品系評價[75-76]。

4 結 論

在非生物逆境脅迫條件下，番茄通過改變自身的蛋白質表達水平對各種非生物脅迫作出響應。蛋白質組學研究能夠全面揭示番茄響應脅迫時其細胞內蛋白質的動態變化規律，鑒定差異表達的蛋白質，是番茄抗逆生物學研究的重要組成部分。隨著高通量蛋白質組技術進步，將有更多的與番茄響應非生物逆境脅迫相關的蛋白或基因被挖掘，非生物脅迫反應的機制及在作物育種過程中鑒定和利用蛋白質標記的可能性。