芪斛楂顆粒對脾虛模型大鼠胃腸功能及免疫系統的影響*

黃甫靜，張金娟，董莉，馮敏，廖尚高，何迅

(1.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；3.葵花藥業集團貴州宏奇有限公司，貴州 六盤水 553400；4.貴州醫科大學 醫藥衛生管理學院，貴州 貴陽 550025)

脾虛證泛指因脾氣虛損引起的一系列脾臟生理功能失常的病理現象及病癥。飲食不節、勞逸失度、久病體虛等都會使脾氣受損而引起脾虛證的發生，繼而出現神疲、乏力、厭食、便溏和腹痛等癥狀。現代研究表明，“脾失健運”主要表現為胃腸消化、吸收功能的減弱和胃腸內分泌的失調[1-3]，以及免疫功能降低等方面的改變[4-6]，是多器官、多系統出現功能減退的綜合性證候[7]，胃腸功能紊亂是其病理改變的主要特征。芪斛楂顆粒系由黃芪、山藥、炙甘草等11味藥味組成的中藥制劑，在用于治療小兒脾胃氣虛、脾失健運證引起的厭食、偏食、汗多、大便不調、易感冒等癥狀時療效顯著，但其改善脾虛引起的胃腸功能紊亂和免疫力低下的作用尚不明確。本研究采用飲食不節、過度勞累和苦寒破氣相結合的復合因素法建立脾虛大鼠模型，觀察芪斛楂顆粒對脾虛模型大鼠胃腸功能及免疫系統的影響，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 番瀉葉(亳州市茸文堂藥業有限公司,批號200708)、補中益氣顆粒(北京漢典制藥有限公司,批號191139)、芪斛楂顆粒[葵花藥業集團(貴州宏奇),批號20190401]、胃泌素(gastrin，GAS)、胃動素(motilin，MTL)、生長抑素(somatostatin，SS；武漢華美生物工程有限公司,批號X23014011、X21014009、X22014010)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α；深圳欣博盛生物科技有限公司,批號200106-102a)、白介素-1β(interleukin，IL-1β；河南九邦生物科技有限公司,批號Nov 2020)。

1.1.2儀器 多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)、Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、Step One PlusTM型實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀(美國Thermofisher scientific公司)、CP124C型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司]。

1.1.3動物 雄性SD大鼠，無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級，體質量180～220 g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(黔)2018-0001。

1.2 方法

1.2.1動物分組、造模與給藥 雄性SD大鼠30只，采用飲食不節、過度疲勞和苦寒破氣相結合的復合因素法建立脾虛大鼠模型。造模方法參照文獻[16]，于造模第1～14天，奇數日給予豬油(10 mL/kg)灌胃，并以實驗鼠飼料喂養，偶數日僅以白菜喂養并使大鼠于室溫下游泳至力竭；第15～21天，給予番瀉葉水提物(0.5 g/kg)灌胃。取同批次未造模大鼠10只作為對照組。將造模成功的30只脾虛大鼠隨機分為模型組、陽性對照組(補中益氣顆粒，630 mg/kg)以及芪斛楂顆粒組(200 mg/kg)，每組10只；各組大鼠予相應藥物灌胃，對照組和模型組予等量蒸餾水灌胃，每天1次，連續10 d。末次給藥后24 h，水合氯醛麻醉各組大鼠，心臟采血，常溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取血清，保存于-20 ℃備用。

1.2.2外觀行為學評分和體質量 記錄各組每只大鼠的外觀行為學變化，按行為評分標準[8-9]進行評分(表1)；每周稱量大鼠的體質量兩次，參照評分標準結合大鼠體質量變化情況，評分顯著升高且體質量顯著降低的大鼠評價為脾虛模型大鼠，以造模成功的大鼠進行后續試驗，末次給藥后按評分標準再次對各組大鼠進行評分。

表1 各組大鼠外觀行為學評分標準Tab.1 Appearance and behavior evaluation scale of rats in each group

1.2.3胸腺、脾臟指數測定 采血后，脫頸椎處死大鼠，取胸腺和脾，計算胸腺、脾臟指數，臟器指數=臟器質量/大鼠體質量×100%。

1.2.4血清GAS、MTL、SS、TNF-α、IL-1β含量 取各組大鼠血清，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中GAS、MTL、SS、TNF-α、IL-1β的含量，按照各試劑盒的說明書進行操作，均使用酶標儀進行測定。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 外觀行為學評分和體質量

與對照組比較，模型組大鼠外觀行為學評分顯著升高(P<0.01)、體質量降低(P<0.01)。與模型組比較，陽性對照組和芪斛楂顆粒組大鼠外觀行為學評分值顯著下降(P<0.01)、體質量增加(P<0.01)；給藥結束后，陽性對照組和芪斛楂顆粒組大鼠體重已趨于正常水平，與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2和圖1。

表2 末次給藥后各組大鼠外觀行為學評分Tab.2 Appearance and behavior scores of rats in each group after the last

圖1 給藥期間各組大鼠體質量變化Fig.1 Changes in body mass of rats in each group during administration

2.2 胸腺、脾臟指數的影響

與對照組比較，模型組大鼠胸腺、脾指數均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和芪斛楂顆粒組大鼠的胸腺、脾指數升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。圖2 芪斛楂顆粒對脾虛大鼠胸腺、脾指數的影響Fig.2 Effect of qihuzha granules on thymus and spleen index in rats with spleen deficiency

2.3 血清GAS、MTL及SS水平

與對照組比較，模型組大鼠血清GAS、MTL水平顯著降低(P<0.01)、SS含量顯著上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和芪斛楂顆粒組大鼠血清GAS、MTL水平顯著升高(P<0.01)、血清SS含量顯著降低(P<0.01)。見圖3。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。圖3 芪斛楂顆粒對脾虛模型大鼠胃腸激素的影響Fig.3 Effect of qihuzha granules on gastrointestinal hormones in rats with spleen deficiency

2.4 血清TNF-α、IL-1β水平

與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和芪斛楂顆粒組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

3 討論

中醫理論中的脾是多個器官和系統的集合，除西醫解剖學中的脾臟外，還包括了消化系統、免疫系統、循環系統等多個系統及器官[10]。因此，中醫理論中的脾虛是指因過勞過逸、飲食不節、思慮過度等原因引起的多個器官或系統功能低下的證候。采用飲食不節、過度勞累和苦寒破氣的復合因素建立脾虛大鼠模型的方法充分模擬了中醫脾虛癥的病因，具有脾虛癥狀明顯、重復性高、穩定性強的特點，已成為研究脾虛癥較為經典的模型[11-14]。本研究中，采用奇數日灌胃豬油、偶數日喂食白菜，使大鼠游泳至力竭，于造模第15天開始予番瀉葉水提物灌胃的方法模擬脾虛大鼠模型。造模后，大鼠的體質量增長緩慢且顯著低于對照組，出現食量減少、便型稀軟、瞇眼弓背、毛發枯燥、懶動等癥狀，胸腺、脾指數顯著降低，反映出脾虛大鼠模型的外觀行為、臟器系數的變化；而且大鼠血清GAS、MTL水平顯著降低，TNF-α、IL-1β和SS顯著上升，提示脾虛大鼠的胃腸功能、免疫系統有一定的受損。以上結果表明采用飲食不節、過度勞累結合苦寒破氣的復合因素造模后可引起胃腸功能和免疫系統異常，從而更接近臨床脾虛證侯。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。圖4 芪斛楂顆粒對脾虛模型大鼠血清TNF-α和IL-1β的影響Fig.4 Effect of qihuzha granules on serum TNF-α and IL-1β in rats with spleen deficiency

本實驗中，對復制成功的脾虛大鼠模型給予芪斛楂顆粒進行干預，結果顯示：與模型組比較，芪斛楂顆粒組大鼠的外觀行為學評分顯著下降、體質量顯著升高，提示芪斛楂顆粒通過緩解脾虛大鼠的外觀行為學癥狀，使大鼠的體質量逐漸增加。

脾臟對維持機體免疫系統功能的正常運轉有重要作用，研究表明脾虛證可導致機體全身和局部免疫功能低下[15]。胸腺和脾臟在維持機體正常免疫功能中，發揮了極為重要的作用[16-18]。胸腺指數、脾指數的變化能夠反映脾虛模型大鼠機體免疫功能恢復的狀況。TNF-α和IL-1β主要參與免疫應答、造血和炎癥的調節，是機體發生細胞免疫時的關鍵性細胞因子，對免疫細胞的增殖與活化均有較強的作用[19]。機體在脾虛時出現免疫功能紊亂，細胞因子異常分泌，使TNF-α和IL-1β的含量增多，進一步的加重機體胃腸道等的損傷而加重脾虛的癥狀。本研究結果顯示，經給藥干預后，脾虛模型大鼠的胸腺指數和脾指數均較模型組顯著上升，TNF-α和IL-1β的含量均較模型組顯著下降，提示芪斛楂顆粒可能通過上調脾虛大鼠的胸腺指數和脾指數，減少血清TNF-α和IL-1β的含量來改善脾虛大鼠的免疫功能而起到保護作用。

研究表明脾虛證與胃腸道的胃腸激素分泌、胃腸免疫調節功能障礙等多種病理生理改變都有關系[20-21]。胃腸激素在調節胃腸平滑肌收縮、促進胃腸道分泌和維持胃腸道屏障等方面具有重要作用[22-23]。MTL、GAS、SS均是重要的胃腸激素，具有促進或抑制胃腸運動，加速胃腸黏膜再生的作用，三者均能很好的體現胃腸功能變化[24-25]。本研究結果顯示，經芪斛楂顆粒干預后，脾虛模型大鼠血清GAS、MTL的含量較模型組在不同程度上有所上升，血清SS有所下降，提示芪斛楂顆粒改善脾虛大鼠胃腸功能可能與其調節胃腸激素的作用有關。

涂儀軍[26]的研究中提到，IL-1β可導致胃腸功能紊亂，TNF-α可引起局部炎癥反應。本研究中，脾虛大鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平上升，同時GAS、MTL和SS等胃腸激素的分泌水平也出現了異常，其可能原因為脾虛證引起機體免疫功能降低，從而導致機體胃腸屏障功能低下，胃腸激素分泌異常。本研究結果顯示，芪斛楂顆粒可以通過提高脾虛模型大鼠胸腺指數、脾指數、GAS、MTL含量，降低SS、TNF-α、IL-1β含量，從而改善脾虛大鼠胃腸、免疫功能。