細(xì)胞毒性檢查法中相對(duì)增殖度法與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)法的對(duì)比研究

洪燕，尹宇文，周年，劉寧，鄭洋濱

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.南昌市衛(wèi)生健康促進(jìn)中心，江西 南昌 330008

藥包材即藥品和醫(yī)院制劑所使用的直接與藥品接觸的包裝材料和容器。作為藥品的一部分，藥包材本身的質(zhì)量、安全性、使用性能以及藥包材與藥物之間的相容性對(duì)藥品質(zhì)量有著十分重要的影響［1］。通常情況下藥包材的生物學(xué)指標(biāo)即生物性能考察項(xiàng)目一般根據(jù)所包裝藥物制劑的要求制定，如注射劑類藥包材的檢驗(yàn)項(xiàng)目包括細(xì)胞毒性、急性全身毒性實(shí)驗(yàn)和溶血實(shí)驗(yàn)等；滴眼劑瓶應(yīng)考察異常毒性、眼刺激實(shí)驗(yàn)等［2］。其中細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是一類在離體狀態(tài)下模擬生物生長(zhǎng)環(huán)境,檢測(cè)藥包材材料接觸機(jī)體組織后生物學(xué)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，它是生物學(xué)評(píng)價(jià)體系中最常用的檢測(cè)指標(biāo)之一［3］。

相對(duì)增殖度法為《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》最常用的方法,但由于其實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜煩瑣，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。ISO 10993-5:2009 和美國(guó)藥典USP（43 版）收載的細(xì)胞毒性方法正文中有三種：浸提法、直接接觸法、間接接觸法（瓊脂擴(kuò)散法等），均未收載相對(duì)增殖度法。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)是目前廣泛應(yīng)用的一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果真實(shí)客觀，是實(shí)際應(yīng)用最廣的細(xì)胞毒性檢查方法。故本研究采用L-929 細(xì)胞株作為觀察對(duì)象，比較相對(duì)增殖度法和MTT 法兩種細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法在應(yīng)用中的差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MULTISKAN GO 酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司），倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡儀器有限公司），IC1000 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（艾力特生命科學(xué)有限公司），BS224S 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥

L929 細(xì)胞系（ATCC），1640 細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶，PBS 緩沖液，MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑鹽溴化物］，二甲基亞砜（DMSO）、苯酚。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品

26 批藥包材，三層共擠輸液用袋3 批、外阻隔袋五層共擠輸液用膜制袋3 批、三層共擠輸液用膜3 批、五層共擠輸液用膜3 批、預(yù)灌封注射器用不銹鋼針2 批、塑料輸液容器用聚丙烯組合蓋3 批、塑料輸液容器用聚丙烯組合蓋2 批、塑料輸液容器用聚丙烯組合蓋1 批、膠塞6 批。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT 溶液的配制

取MTT500 mg 溶于100 mL PBS 緩沖液，濃度為5 mg/mL，過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存。

2.2 樣品浸提液的制備

供試品的浸提比例參考《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》。使用含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃浸提24 h。空白對(duì)照品溶液為不加供試品的含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。陰性對(duì)照品溶液為高密度聚乙烯浸提液。陽(yáng)性對(duì)照品溶液為5%二甲基亞砜（DMSO）和6.3%苯酚溶液。

2.3 細(xì)胞懸液的制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-929 細(xì)胞消化吹打計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL 和4×104個(gè)/mL。

2.4 MTT 比色法

取1×104個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 的量將細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，每孔分別加入100 μL 的空白對(duì)照液、陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液、樣品浸提液，每組6 孔。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO。振蕩10 min 后在酶標(biāo)儀上用570 nm 和630 nm 波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度。通過(guò)以下公式計(jì)算相對(duì)增殖度（RGR），并分級(jí)。RGR=實(shí)驗(yàn)組（陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照組）吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100%。

2.5 相對(duì)增殖法

取4×104個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別加入細(xì)胞懸液1 mL，細(xì)胞培養(yǎng)液4 mL，置于37 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液。其中13 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入5 mL 陰性對(duì)照品溶液；10 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入5 mL 陽(yáng)性對(duì)照品溶液；實(shí)驗(yàn)組每批10 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別加入5 mL 含50%供試液的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

在更換細(xì)胞培養(yǎng)液的當(dāng)天取3 瓶陰性對(duì)照組觀察細(xì)胞形態(tài)，并在更換細(xì)胞培養(yǎng)液后的第2，4，7天，每組各取3 瓶，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)［4］。根據(jù)各組細(xì)胞濃度按下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖RGR=實(shí)驗(yàn)組（陽(yáng)性對(duì)照組）細(xì)胞濃度平均值/陰性對(duì)照組細(xì)胞濃度平均值×100%。

2.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

按細(xì)胞毒性分級(jí)表評(píng)價(jià)26 批樣品的細(xì)胞毒性，見表1。

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)表（%）

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品細(xì)胞增殖度的影響

通過(guò)兩種不同的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法，26 批藥包材均表現(xiàn)出較好的安全性，細(xì)胞毒性分級(jí)均未超過(guò)2 級(jí)，結(jié)果見表2。

表2 不同實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品細(xì)胞增殖度的影響

3.2 相關(guān)性分析

將26 批藥包材數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法之間存在高度相關(guān)性（R=0.971，P<0.001），見表3。

表3 兩組實(shí)驗(yàn)方法相關(guān)性分析

4 結(jié)論

藥包材是由一種或多種材料制成的包裝組件組合而成，應(yīng)具有良好的安全性、適應(yīng)性、穩(wěn)定性、功能性、保護(hù)性和便利性，在藥品的包裝、貯藏、運(yùn)輸和使用過(guò)程中起到保護(hù)藥品質(zhì)量安全、有效，實(shí)現(xiàn)給藥目的的作用。藥包材的質(zhì)量對(duì)藥品質(zhì)量的影響是至關(guān)重要的，包材中的某些有毒物質(zhì)可能被藥品溶出，藥品中的有些成分可能在包裝存放過(guò)程中被包裝材料吸附或與包裝材料發(fā)生反應(yīng)，而直接影響了藥品質(zhì)量或用藥劑量［5］。因此對(duì)藥包材生物安全性的重視應(yīng)等同于對(duì)藥品本身安全性的重視。

細(xì)胞毒性是指將一定量的供試品溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、增殖和抑制影響的觀察，評(píng)價(jià)供試品對(duì)體外細(xì)胞的潛在毒性作用［6］。《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》中細(xì)胞毒性可分為相對(duì)增殖度法、瓊脂擴(kuò)散法、直接接觸法和浸提法4種［2］，相對(duì)增殖度法為最常用的方法，其實(shí)驗(yàn)方法采用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)并給毒，通過(guò)材料的浸提液與培養(yǎng)的細(xì)胞廣泛接觸，經(jīng)過(guò)7 d 的細(xì)胞培養(yǎng)，計(jì)數(shù)并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，可分析材料中各組成成分及其濃度和細(xì)胞毒性等級(jí)。然而該方法存在操作煩瑣，細(xì)胞經(jīng)72 h 培養(yǎng)，生長(zhǎng)活力一般都達(dá)到旺盛階段，培養(yǎng)7 d，細(xì)胞或已出現(xiàn)衰老凋亡現(xiàn)象，極易造成假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成誤差。在相對(duì)增殖度法中要求在更換后第2、4、7 天，每組各取3 瓶進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)［7］。然而在結(jié)果評(píng)價(jià)中，僅以第7 天的細(xì)胞濃度計(jì)算作為判斷依據(jù)，這顯然不合理。而且該方法還存在結(jié)果的重現(xiàn)性和均一性較差，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，需對(duì)相對(duì)增殖度法進(jìn)行全面研究，找出更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)潔的替代法。MTT法的檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比［8-10］。

本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同的體外細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，觀察26 種材料的浸提液對(duì)L929 細(xì)胞增殖度的影響。兩種實(shí)驗(yàn)方法所得結(jié)果具有一致性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩種浸提方法之間存在高度相關(guān)性。與相對(duì)增殖度法比較，MTT 法由于其實(shí)驗(yàn)周期短，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果更加客觀，大大的提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，更適合于對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，是相對(duì)增殖度法的比較好的替代檢測(cè)方法。