外源滲透調節物質對黃芩幼苗抗旱能力的影響研究

李小玲,賀廣祥,華智銳

(1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院,陜西 商洛 726000;2.陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院有限公司,陜西 商洛 726000)

干旱是植物所面臨的非生物逆境(干旱、鹽堿、低溫等)因素之一,其造成的損失最為嚴重。植物在受到干旱脅迫后,其細胞脂膜的正常結構會被破壞,細胞膜上的蛋白發生移位,最終會導致細胞膜滲透性增加、膜選擇性喪失,從而導致細胞原生質失水,細胞器和細胞質中的酶活性大大降低,甚至完全變性[1]。在干旱逆境下,可溶性糖(蔗糖、葡萄糖)、脯氨酸和甜菜堿等有機滲透調節物質對調節植物組織的滲透性、維持細胞膨壓、促進組織光合作用、清除植物體內活性氧自由基等有著重要作用,進而可以提高經濟植物在逆境下的收獲指數和產量。

黃芩(SctellariabaicalensisGeorigi)是屬于唇形科(Lamiaceae)黃芩屬(Scutellaria)的多年生草本藥用植物,是我國常用的大宗中藥材及秦嶺五大商藥之一[2],在我國主要分布于山東、山西、陜西、甘肅四大產區,具有較強的耐寒、耐旱特性且主要在旱地栽培。近年來,隨著全球性的氣候異常和生態平衡被破壞,黃芩的生物學和藥學品質受到嚴重影響,制約了黃芩產業的可持續發展。目前,通過施加不同濃度的外源物質來增強植物抗逆性的化控措施已成為繼生物學改良后提高植物抗性的又一條有效途徑。

聚乙二醇(PEG-6000)是一種高分子滲透劑,是模擬生物干旱脅迫的常用材料之一[3,4],可將其配制成一定濃度梯度的水勢溶液,模擬土壤的自然水勢。糖類是植物光合作用的主要產物之一,在植物組織、器官中的主要作用是為物質代謝提供能量,為核酸、蛋白質和脂類的合成提供碳骨架,同時也是植物細胞主要的有機滲透調節物質[5]。在干旱脅迫條件下,植物的生理代謝發生紊亂,其細胞大量積累小分子有機滲透化合物,如可溶性糖(主要有葡萄糖、果糖、蔗糖)等,通過這些化合物來降低水勢,從而維持較高的滲透壓,保證細胞的生理功能正常。所以可溶性糖的含量是反映植物抗旱性的重要指標之一[6]。游離脯氨酸廣泛存在于植物細胞內,是植物體內為數不多的滲透調節物質之一。脯氨酸代謝能在逆境脅迫下有效保護植物的生長發育過程。相關研究表明,脯氨酸具有調節滲透壓、減少水分散失等生理生化作用。脯氨酸還能與變性的蛋白質結合,防止變性蛋白凝集。脯氨酸也是一種抗氧化劑,可清除細胞內部的活性氧(ROS)。甜菜堿于植物體內廣泛存在,是一種永久性或半永久性滲透保護物質。楊麗娜等[7]的研究表明,在前期水分脅迫下,通過增加可溶性糖和脯氨酸含量,甜菜堿處理提高了樹體的滲透調節能力。甜菜堿既能與酶和蛋白質生物大分子的親水區結合,又能與其疏水區結合,這種獨特的性質對其發揮滲透調節和保護功能具有重要意義[8]。

本文以商洛道地藥材黃芩為研究材料,通過模擬干旱,探討了幾種滲透調節物質(葡萄糖、脯氨酸、甜菜堿)對商洛黃芩抗旱能力的影響,以期為探尋增強黃芩抗旱能力的栽培措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用黃芩幼苗購自洛南藥材種植基地,為一年生幼苗。甜菜堿(GB)、脯氨酸(Pro)、葡萄糖(Glc)和PEG-6000購自西安晶博有限公司,含量≥99.5%,分析純試劑AR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預培養及處理 將黃芩幼苗移栽到塑料花盆(直徑10 cm,高15 cm)中進行預培養,在緩苗期間定時澆水、松土，以保持土壤濕潤，使幼苗恢復至正常生理狀態。每盆培養3～5株,每個處理9盆。在1周后選取生長一致的幼苗用于試驗。試驗共設2個對照、15個處理,如表1所示。

表1 試驗處理和對照設置

用不同濃度的GB、Pro、Glc和蒸餾水、20%PEG-6000隔天噴施相應處理的黃芩幼苗葉片,只噴施葉片正面,以防止粘稠的PEG將葉片表面覆蓋,阻礙正常氣體交換；參照汪月霞等[9]的方法用手持式噴霧器均勻噴施,至葉片濕潤滴水時停止噴施；連續噴施1周；在1周后隨機選取處理的植株進行生理指標的測定。每種藥劑重復5次,每次重復9株苗。

1.2.2 指標的測定方法 采用稱重法測定地上部和地下部重量,計算根冠比[10];葉綠素含量的測定參照張志良等[10]的丙酮-碳酸鈣法;MDA含量的測定參照張志良等[10]的硫代巴比妥酸(TBA)檢測法;脯氨酸含量的測定參照李合生等[11]的酸性茚三酮法;可溶性糖含量的測定參照李合生等[11]的苯酚法;POD活性的測定參照李合生等[11]的愈創木酚法;SOD 活性的測定參照李合生等[11]的氮藍四唑法;CAT活性的測定參照高俊風等[12]的紫外吸收法;質膜透性的測定參照張以順等[13]的相對電導率法。

1.3 數據統計分析

數據統計、作圖采用Excel 2010軟件進行,用SPSS statistics 22.0軟件進行數據分析。各項生理指標的測定重復5次,求其平均值。

2 結果與分析

2.1 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗根冠比的影響

由圖1可知：與CK1相比,CK2的黃芩幼苗的根冠比明顯升高,增幅達到40%,差異達顯著水平(P<0.05)；在干旱脅迫下，經不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理后,根冠比整體呈下降的趨勢,均與CK2差異達到顯著水平；隨著處理濃度的升高,根冠比降低的趨勢明顯不同,在200 mg/L GB、Pro、Glc處理濃度下根冠比的降幅均達到最大,與CK2相比分別降低了34.3%、17.1%、25.7%,說明200 mg/L GB的處理效果最好,Glc次之。

在同一處理濃度下,標有不同字母的處理間在0.05水平上差異顯著，下同。

2.2 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可知：與CK1相比，CK2的葉綠素含量顯著降低(P<0.05),說明干旱脅迫處理對黃芩葉片中的葉綠素含量有顯著影響；經不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理后,葉綠素含量整體呈上升的趨勢,均與CK2差異達到顯著水平；在100、150 mg/L 3種外源物質處理濃度下,黃芩幼苗的葉綠素含量未出現顯著性差異；在200 mg/L處理濃度下,外源甜菜堿與葡萄糖對黃芩幼苗葉綠素含量的影響效果相當,與外源脯氨酸的差異達到顯著水平,這兩種處理與CK2相比增幅達到最大,分別為70.6%和69.7%。

圖2 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗葉綠素含量的影響

2.3 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響

由圖3可知：CK2與CK1相比,黃芩幼苗的MDA含量明顯升高,增幅達到18.3%,差異達顯著水平(P<0.05)；經不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理后,MDA含量整體呈下降的趨勢,均與CK2差異達到顯著水平；隨著處理濃度的升高,MDA含量降低的趨勢先強后弱,在200 mg/L處理濃度下MDA含量的降幅均達到最大,與CK2相比分別降低了27.2%、20.3%、20.4%,以200 mg/L GB的處理效果最好。

圖3 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響

2.4 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗可溶性糖含量的影響

由圖4可知：CK2與CK1相比，可溶性糖的含量明顯上升,說明干旱脅迫對黃芩葉片中的可溶性糖含量有顯著影響；經不同濃度的外源滲透調節物質(GB和Glc)處理后,可溶性糖含量整體呈上升的趨勢,除100 mg/L GB外其他處理均與CK2差異達到顯著水平(P<0.05)；在噴施不同濃度的外源滲透調節物質Pro后可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢,但也與CK2差異達到顯著水平；在150 mg/L Pro處理下可溶性糖含量的增幅達到最大,為16.4%；在200 mg/L GB和Glc處理下可溶性糖含量的增幅均達到最大,分別為23.6%和43.00%。因此，200 mg/L Glc處理對可溶性糖含量的影響最大,效果最佳。

圖4 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗可溶性糖含量的影響

2.5 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

由圖5～圖7可知：CK2與CK1相比，黃芩幼苗葉片中的SOD、POD、CAT活性均顯著升高,說明干旱脅迫對黃芩葉片中的保護酶活性有顯著影響。由圖5可知：經不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理后,SOD活性整體呈先上升后下降的趨勢,與CK2的差異均達到顯著水平(P<0.05)；在干旱脅迫下，經200 mg/L 3種外源物質處理后SOD活性的增加趨勢最為顯著,增幅最大,分別比CK2增加了15.7%、10.2%、13.0%。由圖6可知:除100 mg/L Pro處理外,在其他處理與CK2間POD活性的差異均達到了顯著水平；在150 mg/L處理濃度下,外源GB和Glc對POD活性的影響差異不大；在200 mg/L處理濃度下,3種外源物質處理與CK2比較，POD活性的增加趨勢最為顯著,增幅最大,分別為18.0%、14.7%、20.0%。由圖7可知:CK2與CK1相比,黃芩幼苗葉片中的CAT活性顯著升高；外源物質GB和Pro在100 mg/L處理濃度下對黃芩幼苗CAT活性的影響效果相當,與CK2的差異均達到了顯著水平；在150 mg/L處理濃度下Pro和Glc對黃芩幼苗CAT活性的影響效果相當,與CK2的差異均達到了顯著水平；在200 mg/L處理濃度下GB和Glc對黃芩幼苗CAT活性的影響效果相當,與CK2的差異均達到了顯著水平。總體上,在噴施不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)后,黃芩幼苗葉片中的CAT活性整體上呈先上升后下降的趨勢,除100 mg/L Glc處理外與CK2的差異均達到了顯著水平。在200 mg/L處理濃度下,3種外源物質處理與CK2比較,CAT活性的增加趨勢最為顯著,增幅最大,分別為20.8%、11.8%、19.6%。總之,3種外源物質都能顯著增加干旱脅迫環境下黃芩幼苗葉片中保護酶SOD、POD、CAT的活性，且以施加200 mg/L的效果最佳。

圖5 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗SOD活性的影響

圖6 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗POD活性的影響

圖7 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗CAT活性的影響

2.6 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

由圖8可知：CK2與CK1相比,干旱脅迫后黃芩葉片中的脯氨酸含量顯著增加；經不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理后,脯氨酸含量整體呈上升的趨勢,均與CK2差異達到顯著水平(P<0.05)；在100、150 mg/L處理濃度下,3種外源物質對黃芩幼苗葉片脯氨酸含量的影響效果相當,與CK2的差異均達到了顯著水平；在200 mg/L處理濃度下,GB與Pro、Glc對黃芩幼苗葉片脯氨酸含量的影響效果相當,但在Pro和Glc處理間差異達到了顯著水平。在5個處理濃度中，以200 mg/L GB和Pro促進脯氨酸含量增加的效果最為顯著,分別比CK2增加了13.8%、17.4%；在3種外源調節物質中，以Pro的處理效果最佳,GB次之。

圖8 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

2.7 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗相對電導率的影響

由圖9可知：CK2與CK1相比，黃芩幼苗葉片的相對電導率顯著升高,差異達到了顯著水平(P<0.05)，說明干旱脅迫已造成黃芩葉片膜結構破壞或功能受損,膜透性增大，從而導致細胞內水溶性物質外滲；經不同濃度的外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理后,相對電導率整體呈下降的趨勢,與CK2的差異均達到顯著水平；在100 mg/L處理濃度下,GB和Glc對黃芩幼苗葉片相對電導率的影響效果相當,但均比Pro差；在150和200 mg/L處理濃度下,3種外源物質對黃芩幼苗葉片的相對電導率均有顯著的影響,以200 mg/L GB處理的效果最為顯著,與CK2相比的相對電導率降幅高達35.3%,而Glc次之,降幅高達20.8%。

圖9 外源滲透調節物質對干旱脅迫下黃芩幼苗相對電導率的影響

3 討論

植物在感知干旱逆境脅迫時會啟動相應的防御機制,比如通過信號轉導及相關基因的表達引發滲透調節和激素調節等代謝途徑的變化[14]。在干旱逆境下,植株內的滲透調節物質會大量積累,通過降低滲透勢來平衡水勢的降低。積累的滲透調節物質主要包括脯氨酸、可溶性糖(葡萄糖、果糖、蔗糖等)和甜菜堿等有機小分子化合物。可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿等物質能夠減小植物細胞水勢和穩定膨壓,保持細胞健康生長以及清除自由基，緩解細胞衰老，還能通過提高光合速率、維持氣孔導性、促進光能捕獲等來提高植物在干旱脅迫逆境下的光合作用。根冠比可以反映植物在遭受逆境脅迫后地上、地下部分生長平衡的變化。本研究發現：在干旱脅迫下,隨著添加外源物質濃度的增加,各處理黃芩幼苗的根冠比降低；在同一處理濃度下,與CK2相比，以甜菜堿處理的根冠比降低幅度最大,葡萄糖的作用效果次之;隨著外源物質處理濃度的增加,根冠比呈降低的趨勢,以200 mg/L甜菜堿處理的根冠比最小。由此表明,施用適量的外源物質可以降低黃芩幼苗的根冠比,改善幼苗地上部分的生長，以200 mg/L甜菜堿的處理效果最佳。

葉綠素是與光合作用息息相關的一種色素。趙博生等[15]的研究結果表明,施用外源甜菜堿有利于作物對光能的捕獲和轉換,明顯促進作物的生長,降低干旱、鹽脅迫對作物的抑制作用。本試驗的結果與前人的研究結果一致,在遭受干旱脅迫后,黃芩幼苗葉片中的葉綠素含量顯著下降；但不同濃度的甜菜堿處理均可提高黃芩幼苗葉片中的葉綠素含量,以200 mg/L處理的效果最佳。錢永生等[16]的研究表明,滲透調節物質脯氨酸不僅可以參與葉綠素的合成,而且對蛋白質起保護作用。本研究證實外源物質脯氨酸可以在干旱環境下促進黃芩幼苗葉片中葉綠素的合成。

MDA是細胞膜脂過氧化作用的主要產物之一,能真實反映植物在遭受逆境脅迫后細胞內有害物質的積累程度[17]。在本試驗中,黃芩幼苗遭受干旱逆境時,MDA含量顯著升高,但在施加不同濃度的外源物質后MDA含量顯著降低,隨著處理濃度變大,MDA含量降低越明顯,以200 mg/L GB的效果最明顯,這與前人的研究結果[18]一致。說明葉面噴施適量的GB能顯著緩解脫水過程中產生的氧自由基對質膜的傷害。

可溶性糖是植物的主要有機滲透調節劑之一,也是作物碳架和能量的主要來源,在穩定細胞膜和原生質膠體方面發揮著重要的作用[19]。在水分脅迫期間,糖的積累能降低植物滲透壓,從而起到保水作用,因此糖也是植物適應機制中的重要信號物質[20]。在本試驗中,黃芩幼苗在遭受干旱逆境時,可溶性糖含量顯著升高,從而降低滲透壓,對黃芩幼苗進行保水。加入200 mg/L的外源物質對可溶性糖含量的影響最為顯著，以200 mg/L葡萄糖的效果最為明顯,甜菜堿次之。

干旱脅迫導致植物體內產生大量的ROS,啟動膜脂過氧化反應,進而引起細胞膜受損,而脂膜損傷又是導致植物衰老和組織傷害的重要原因。植物能通過酶保護系統(SOD、POD和CAT等)和非酶促防御系統清除活性氧自由基,保護植物細胞膜免受傷害,從而保證其生理過程的正常進行[21]。張立新等采用盆栽試驗研究表明,在水分脅迫條件下,添加甜菜堿處理能提高夏玉米的SOD、POD和CAT活性,降低MDA含量,緩解膜脂過氧化傷害[22]。本試驗也得到了相同的結果,在干旱脅迫下抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性提高,以此對黃芩幼苗進行保護。外源滲透調節物質處理提高了黃芩幼苗的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性,緩解了活性氧自由基的膜脂過氧化傷害。以200 mg/L甜菜堿處理的綜合效果最佳,葡萄糖次之,可能與糖參與適應機制的重要信號通路有關。

脯氨酸常以游離狀態廣泛存在于植物體內,是植物蛋白的組分之一,其含量的增加是植物遭受干旱脅迫的敏感征兆之一,它通過參與植物滲透調節作用對蛋白質具有一定的保護作用[23]。本試驗發現：在干旱脅迫下，黃芩幼苗體內脯氨酸含量顯著升高；經外源滲透調節物質處理后,黃芩幼苗體內脯氨酸含量增加,以200 mg/L脯氨酸的作用效果最佳,甜菜堿和葡萄糖次之。

干旱脅迫會破壞植物組織的膜脂結構和功能,導致膜脂通透性增大,細胞內各種水溶性物質出現不同程度的外滲,外滲物越多則電導率越大,所以通過電導儀測定外滲電導率就能得知膜受傷害的程度[24]。本研究發現：干旱脅迫處理后黃芩幼苗葉片的相對電導率顯著升高,說明膜透性增大；加入外源滲透調節物質后葉片的相對電導率明顯降低,以200 mg/L GB處理的效果最為顯著。這一結果與邱念偉等[18]對煙草的研究結果一致。隨著噴施甜菜堿濃度的升高,葉片相對電導率下降,說明葉面噴施甜菜堿能顯著增加細胞膜的穩定性。葡萄糖的作用效果次之。

綜上所述,在遭受干旱脅迫后黃芩幼苗的各種生理指標發生了顯著變化(P<0.05)；3種外源滲透調節物質(GB、Pro和Glc)處理均可提高干旱脅迫環境下黃芩幼苗葉片的葉綠素含量、可溶性糖含量、保護酶(SOD、POD、CAT)活性和脯氨酸含量,降低根冠比、MDA含量和相對電導率；以200 mg/L的效果最佳；在200 mg/L處理濃度下，綜合效果以GB最佳,Glc次之。