短葉羅漢松雌雄株葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的比較研究

楊鳳蘭,鄧冬麗,招禮軍,朱栗瓊*

(1.廣西大學(xué) 林學(xué)院,廣西 南寧 530004;2.廣西國際商務(wù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530000)

雌雄異株是自然植物界中常見的一種現(xiàn)象,在植物界30多萬種被子植物中就存在著4%～10%的雌雄異株植物[1]。Renner等在對24萬種被子植物資源的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)雌雄異株的植物有959個屬,共14620種[2]。在長期的演化過程中,雌雄異株植物的生長特性、資源分配、生理生化特征和基因表達(dá)等方面存在著一定的性別差異[3]。目前國內(nèi)有關(guān)雌雄異株植物的研究主要集中在基因[4]、生理生化[5-7]和對環(huán)境因子的響應(yīng)差異[8]等方面。研究雌雄異株植物,不僅可在植物早期進(jìn)行性別鑒定,為生產(chǎn)實(shí)踐提供技術(shù)支持,而且還有利于揭示雌雄異株植物在演化過程中的生存適應(yīng)策略。

短葉羅漢松(Podocarpusmacrophyllusvar.maki)為羅漢松科(Podocarpaceae)羅漢松屬(Podocarpus)的一種雌雄異株的常綠小喬木,是羅漢松的一個變種植物,原產(chǎn)于日本和中國云南省,目前廣泛分布于我國各地,栽植的最北界為淮河流域和山東半島,它是羅漢松科植物在我國露地栽培緯度最高的種類[9]。短葉羅漢松的根皮、果實(shí)、葉與羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)相似,可用作藥材,具有殺蟲、治癬疥、治療心胃氣痛等功能[10]。目前對短葉羅漢松的研究較少,主要集中在葉片結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程[10]、生藥性狀[11]和微形態(tài)結(jié)構(gòu)[12]等方面,而對雌雄株葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)特征差異的研究鮮見報道。鑒于此,本文以營養(yǎng)生長期的短葉羅漢松雌、雄植株的成熟葉片作為研究對象,對雌、雄株葉片的解剖結(jié)構(gòu)及表皮形態(tài)進(jìn)行了比較分析,明確了葉片的性別差異,并且探討了短葉羅漢松雌雄株葉片在不斷進(jìn)化過程中對生存環(huán)境的適應(yīng)策略,可以為進(jìn)一步了解和認(rèn)識短葉羅漢松的第二性征,為其育種、栽培等生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)材料采自廣西壯族自治區(qū)南寧市隆安縣那桐鎮(zhèn)金穗園林花木場內(nèi)生長的短葉羅漢松。該地位于廣西的中部偏西南,地理坐標(biāo)為107°21′～108°6′E,22°51′～23°21′N,氣候類型為南亞熱帶季風(fēng)氣候,夏季炎熱多雨,冬季溫暖少雨,降水多集中在夏季,年均降水量為1300 mm,年均氣溫為21.8 ℃,其中,月平均最高氣溫約為28.4 ℃,月平均最低氣溫約為13.2 ℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

在樣地中選取生長健壯和生長勢相同的8年生雌、雄短葉羅漢松各10株,在不同方位、樹冠外圍中上部(頂芽下的第4～5節(jié))分別剪取新鮮成熟健康的雌、雄株葉片各60片。用于測定葉片植紋和解剖結(jié)構(gòu)的30片樣品立即用FAA固定液保存;用于掃描電鏡和透射電鏡觀察的30片樣本置于保鮮盒中帶回室內(nèi),先用緩沖液沖洗干凈，再迅速置于濃度為2.5%的戊二醛固定液中,進(jìn)行抽真空后于4 ℃冰箱中保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葉表皮植紋的觀察 從外形測量完畢的樣品中隨機(jī)選取10片,剪取葉片靠近中脈中部位置約長0.5 cm的部分,放入裝有蒸餾水的試管中,在水浴鍋中加熱15～30 min，然后將蒸餾水換成1∶1的冰乙酸和過氧化氫的混合液,放在60～80 ℃的恒溫中離析24～48 h,當(dāng)葉片出現(xiàn)泛白并有泡沫絮狀物時將葉片取出,用蒸餾水反復(fù)清洗,直到葉肉組織完全去除；取上、下表皮置于番紅-固綠溶液中染色,用蒸餾水裝片,放于Nikon E100顯微鏡下觀察并拍照。雌、雄株至少分別取30個視野,每個指標(biāo)測30個觀測值,統(tǒng)計值使用平均值。觀測指標(biāo)有氣孔長度、寬度,表皮細(xì)胞長度、寬度等,并計算氣孔密度和氣孔指數(shù)，計算公式為：氣孔密度=氣孔數(shù)量/葉片面積；氣孔指數(shù)=氣孔數(shù)/(氣孔數(shù)+表皮細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)的觀察 樣本、采集的視野和觀測數(shù)量以及方法同1.3.1節(jié)。使用雙面刀片徒手切片方法,挑選出薄而均勻的切片,用蒸餾水裝片,置于Nikon E100顯微鏡下觀察并拍照。測量指標(biāo)有:柵欄組織、海綿組織、角質(zhì)層、表皮等的厚度,并用以下公式計算相關(guān)指標(biāo)：柵海比(P/S)=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%；組織結(jié)構(gòu)疏松度(SR)=(海綿組織厚度/葉片厚度)×100%。

1.3.3 葉面掃描結(jié)構(gòu)的觀察 取出置于4 ℃冰箱中固定24 h的樣品15片,吸出原固定液,注入3%戊二醛溶液固定2 h,然后用0.1 mol/L的磷酸溶液沖洗3次,每次15 min;沖洗后加入2%的四氧化鋨緩沖溶液，于室溫固定2 h(用于能譜分析的材料省略此步驟);用0.1%磷酸溶液清洗3次,每次15 min;依次使用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水,該步驟進(jìn)行3次,每個梯度滯留10 min;然后用100%六甲二硅胺烷浸泡3次,每次10 min,再放于真空干燥器中進(jìn)行抽真空干燥;最后粘樣本到樣本座,用Eiko離子濺射儀噴鍍后放在TESCAN VEGF3掃描電鏡下觀察拍照,并使用EDAX能譜分析儀對葉片進(jìn)行能譜分析,選取15個視野進(jìn)行分析并拍照。觀測參數(shù)有角質(zhì)層紋飾、蠟質(zhì)紋飾、氣孔類型和葉片蠟質(zhì)層元素重量之比。

1.3.4 葉片透射結(jié)構(gòu)的觀察 取樣、固定、清洗等步驟同上,之后使用乙醇-丙酮進(jìn)行脫水:50%乙醇→70%乙醇→90%乙醇→1∶1混合液(90%酒精∶90%丙酮)→90%丙酮→3次100%丙酮,每個梯度脫水15 min;用環(huán)氧樹脂對樣品進(jìn)行浸透和包埋;分別將樣品放在38、45和60 ℃中聚合15、12和24 h;使用徠卡UC7超薄切片機(jī)進(jìn)行切片;用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色后放在日立H-1650透射電鏡下進(jìn)行觀察,選取15個視野進(jìn)行拍照。觀測參數(shù)有細(xì)胞長、寬度,線粒體長、寬度和葉綠體的長、寬度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 使用Microsoft Excel 2019對各項(xiàng)結(jié)構(gòu)的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納,運(yùn)用SPASS 23.0軟件對葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)數(shù)量化的參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉表皮植紋

短葉羅漢松雌、雄株的上、下表皮細(xì)胞均排列整齊,均由長、短細(xì)胞組成,上、下表皮的長細(xì)胞多為長矩形,上表皮的短細(xì)胞多為正方形,而下表皮的短細(xì)胞多為長矩形(圖1)。氣孔為典型的平列型,由兩個保衛(wèi)細(xì)胞組成,雌株的氣孔稍大于雄株,其中氣孔寬、氣孔密度和氣孔器長等性狀與雄株存在極顯著差異,而氣孔長、氣孔指數(shù)和氣孔器寬不存在顯著差異(表1)。

表1 短葉羅漢松雌、雄株葉表植紋結(jié)構(gòu)的測量結(jié)果

A：雌株葉片上表皮。B：雌株葉片下表皮。C：雄株葉片上表皮。D：雄株葉片下表皮。黑色箭頭指長細(xì)胞;白色箭頭指短細(xì)胞。

2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)

短葉羅漢松雌、雄株的葉片都為異面葉,均由表皮、葉肉和葉脈組成(圖2)。雌、雄株的葉片解剖結(jié)構(gòu)存在差異(表2),其中雌株的上、下角質(zhì)層厚度和葉中厚極顯著大于雄株,而雄株的柵欄組織,上、下表皮厚度和致密度(CTR)極顯著大于雌株,轉(zhuǎn)輸組織長和柵海比(P/S)則顯著大于雌株;在雌、雄株之間海綿組織厚度、轉(zhuǎn)輸組織寬和細(xì)胞疏松度(SR)差異不顯著。

A:雌株。B：雄株。黑色箭頭指表皮;白色箭頭指海綿組織;紅色箭頭指葉脈;藍(lán)色箭頭指柵欄組織。

表2 短葉羅漢松雌、雄株葉片解剖結(jié)構(gòu)的測量結(jié)果

2.3 葉片表皮微形態(tài)結(jié)構(gòu)

在掃描電鏡下的葉片表面結(jié)構(gòu)特征如表3所示,在上表皮中,雌、雄株的整體表面和角質(zhì)層紋飾差異較大,雌株的表面為皺脊具近平行的凸起橫紋,角質(zhì)層紋飾為平滑的無片狀(圖3A)；而雄株表面具有不規(guī)則的凸起狀橫紋和網(wǎng)狀紋,角質(zhì)層紋飾則為表面粗糙的魚鱗狀凸起與薄片(圖3C)。在下表皮中,雌株表面為光滑的微凸橫紋,細(xì)胞壁為凸起狀(圖3B)；雄株表面有光滑的平整紋路,細(xì)胞壁呈凹陷狀(圖3D)；雌、雄株兩者的氣孔器都呈平滑、成行排列狀。

A：雌株葉片上表皮。B：雌株葉片下表皮。C：雄株葉片上表皮。D：雄株葉片下表皮。

表3 短葉羅漢松雌、雄株葉片表皮的掃描結(jié)構(gòu)特征

2.4 葉片表面蠟質(zhì)能譜分析

葉片表面蠟質(zhì)能譜分析結(jié)果(表4)顯示,雌、雄株的短葉羅漢松葉片中含有相同的9種元素,其中雌株的C、O、Si、Au等元素含量大于雄株,而雄株的Na、Mg、Al、Ca、K等元素含量則大于雌株。

表4 短葉羅漢松雌、雄株葉片表面蠟質(zhì)元素質(zhì)量百分比

2.5 葉片的超微結(jié)構(gòu)

在透射電鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)在雌、雄株葉片的柵欄組織內(nèi)均存在線粒體和葉綠體(圖4)。雌株中的線粒體和葉綠體稍大于雄株,但不存在顯著差異。雌、雄株的細(xì)胞壁厚和細(xì)胞長存在顯著差異,而細(xì)胞寬無顯著差異(表5)。

A：雌株。B：雄株。Chl:葉綠體。CW:細(xì)胞壁。M:線粒體。

表5 在透射電鏡下短葉羅漢松雌、雄株葉片超微結(jié)構(gòu)的測量結(jié)果

3 結(jié)論與討論

雌雄異株是植物適應(yīng)生存環(huán)境變化的一種進(jìn)化表現(xiàn),雌雄異株植物對維持和穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)和保護(hù)物種多樣性有著積極的作用,同時也是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要成員之一[8]。短葉羅漢松是羅漢松的一個變種植物,也是一種雌雄異株植物。在植物的進(jìn)化過程中,葉片被認(rèn)為是對環(huán)境變化最為敏感和具有較強(qiáng)可塑性的植物器官,可在各種壓力下形成應(yīng)對不同逆境的適應(yīng)類型,其形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)植物對環(huán)境的適應(yīng)能力[13]。對雌雄異株的植物而言,雌、雄株的葉片在生理特性[14]、形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)[15-17]以及對環(huán)境因子的響應(yīng)[8]等方面存在著顯著的差異。在一般情況下,雄株的枝條大小、活力和克隆繁殖能力大于雌株[18],尤其是在條件艱苦的環(huán)境下,雄株的個體數(shù)量明顯多于雌株,在空間上兩者也存在著相互排斥的現(xiàn)象[19]。在本研究中,短葉羅漢松雌、雄株的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)特征存在著明顯的性別差異,這是短葉羅漢松雌雄株第二性征[20]在葉片上的表現(xiàn)。

一般認(rèn)為植物葉片的表皮厚度、柵欄組織厚度、柵海比值和葉片致密度在一定程度上與其儲水、控水和抗旱性成正比[17,21]。雄株短葉羅漢松葉片的表皮厚度、柵欄組織厚度、柵海比和致密度均大于雌株,表明雄株的保水能力和抗旱性強(qiáng)于雌株,這與前人的研究結(jié)果[15,22-23]一致。氣孔是植物控制水分和進(jìn)行氣體交換的通道,不僅可以直接影響植物的蒸騰作用[24],還對植物的水分利用、營養(yǎng)吸收、物質(zhì)代謝等方面以及整個生態(tài)環(huán)境的調(diào)節(jié)起重要作用[25]。雌株短葉羅漢松的氣孔寬、氣孔密度和上、下角質(zhì)層厚度極顯著大于雄株,說明雌株葉片不僅氣體交換能力強(qiáng)，而且還可有效防止水分的過度蒸騰,從而促進(jìn)植物的新陳代謝和保持水分。植物葉片的微形態(tài)結(jié)構(gòu)為鑒別雌、雄株植物的差異提供了依據(jù)[12]。在掃描電鏡下短葉羅漢松雌、雄株在葉片表面的蠟質(zhì)紋飾和角質(zhì)層紋飾等微形態(tài)方面存在著明顯的區(qū)別,雄株葉片表面粗糙的魚鱗狀角質(zhì)層紋飾的滯塵能力比雌株平滑無片狀的角質(zhì)層紋飾稍強(qiáng)一些,這可能是在葉片表面所含的9種蠟質(zhì)元素中雄株有5種元素含量大于雌株的原因。

綜上所述,短葉羅漢松雌、雄株葉片表皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征存在明顯的性別差異,且葉片的各項(xiàng)指標(biāo)表明雄株對環(huán)境的適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)于雌株,這可能也是雄株短葉羅漢松在自然界廣泛分布且應(yīng)用頻率高于雌株的原因。本研究結(jié)果有利于在實(shí)踐中區(qū)分短葉羅漢松的雌、雄株,可為其育種和應(yīng)用提供一定的理論參考。