魔芋白絹病菌菌絲生長及微菌核形成的影響因素研究

何 斐,王 冉,雷雨俊,崔 鳴,魯小東

(安康學院 現代農業與生物科技學院,陜西 安康 725000)

魔芋是天南星科多年生草本植物,是目前已知的唯一能大量提供葡甘聚糖的特種經濟作物[1]。魔芋葡甘聚糖在醫藥、食品、化工、紡織及農業等多個行業領域應用廣泛[2]。我國是魔芋生產大國,魔芋產量約占世界總產量的60%[3]。陜南秦巴山區魔芋適生區面積約占全國的1/3,魔芋生產已成為安康、漢中等區域特色經濟主導產業[3-4],也是秦巴山區脫貧致富的支柱產業。然而,隨著種植年限的增加,病害已成為魔芋可持續生產的主要限制因素。

白絹病是近年來在魔芋種植區內發生的一種重要土傳性病害,也是繼軟腐病后的第二大殺手[4]。魔芋白絹病菌有性型為羅氏阿太菌(Atheliarolfsii),無性世代為齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)[5-6]。該病害難以根治的主要原因在于齊整小核菌形成的微菌核對極端環境適應力很強,腐生性也極強[7],可長期潛伏于病殘體、雜草及土壤中,成為該病反復發生的初侵染源。當外界環境適宜時,齊整小核菌菌核萌發形成菌絲,通過雨水等途徑傳播,并分泌細胞壁降解酶為害魔芋葉柄基部和球莖，導致其發病[5]。魔芋根際土壤是齊整小核菌微菌核形成與存在的重要介質,土壤pH、養分狀況與根際分泌物等不僅對魔芋及其根際微生物生長有重要作用,對病原菌微菌核形成也會產生一定的影響。魔芋根際土壤中微菌核的數量及活性直接影響魔芋白絹病的發生與危害程度。因此,研究齊整小核菌微菌核形成的影響因素,對從微生態角度揭示魔芋白絹病發生及流行原因,以及從土壤微生態調控途徑預防魔芋白絹病的發生及減輕其危害具有重要意義。目前魔芋白絹病的研究主要集中在分子鑒定和生物學特性[4,8-9]、白絹病發生危害和防治[4-6]等方面,尚無寄主植物對魔芋白絹病菌微菌核形成影響的報道。作為我國魔芋主產地,秦巴山區魔芋人工大田栽培面積和種植年限逐年增加[10],兩者對魔芋白絹病菌微菌核的影響均大于其他零星種植區域。研究表明,魔芋白絹病的發生與種植年限和菌量存在一定的相關性[6]。本研究通過皿內模擬試驗探究了不同培養條件、魔芋粉、魔芋球莖及根際土壤浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響,進而確定了這些影響因素在魔芋白絹病發生及流行過程中所發揮的作用,可以為闡明秦巴山區魔芋白絹病流行機理及制定該病害的綜合防治措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii),從陜西省漢中市南鄭區三花石村魔芋病害生防試驗田采集的白絹病發病植株中分離獲得。

齊整小核菌的活化與培養采用PDA培養基[11]。

1.2 病原菌菌餅的制備

將齊整小核菌經PDA斜面轉接活化后,取部分菌絲放置于PDA平板中心,在28 ℃下培養7 d,用打孔器切取直徑7 mm的病原菌菌餅，備用。

1.3 培養條件對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

1.3.1 pH 用0.2 mol/L HCl或NaOH調節PDA培養基的pH值,制成pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的供試平板,將菌餅置于平板中央,在28 ℃下培養10 d,每個處理3次重復,下同。

1.3.2 營養條件 分別制備全營養PDA(常規PDA培養基)平板、半營養PDA平板(含無菌水1 L、馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g)和水瓊脂平板(無菌水1 L、瓊脂15 g)。將病原菌菌餅分別置于平板中央,于28 ℃培養10 d。

1.3.3 光照 將病原菌菌餅置于PDA平板中央,分別置于連續光照、連續黑暗及光暗交替(12 h黑暗+12 h光照)條件下,在28 ℃下培養10 d。

1.4 寄主對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

魔芋粉:新鮮魔芋球莖用自來水清洗干凈,去表皮,切成0.5 cm2小塊,在80 ℃下烘干,用粉碎機粉碎后過0.18 mm篩。在PDA培養基中分別加入質量濃度為0(CK)、0.5、1、2、5、10 g/L的魔芋粉,制備成含有不同質量濃度魔芋粉的供試平板。

魔芋球莖浸提液:稱取去表皮、清洗晾干的魔芋球莖10 g,充分研磨后加入100 mL去離子水，混勻；將混合物置于25 ℃搖床上，以120 r/min振蕩1 h,以6000 r/min離心15 min；然后取上清液，用定性濾紙過濾。為保證魔芋球莖浸提液中的活性成分不被破壞,濾出液用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌后，將其置于4 ℃冰箱保藏備用[12]。取一定體積的魔芋球莖浸提液，分別配制含稀釋0、5、10和50倍魔芋球莖浸提液的PDA培養基(編號依次為C0、C5、C10和C50),以不添加浸提液的PDA培養基為對照(CK)；滅菌后冷卻至60 ℃左右的PDA培養基與過濾除菌的魔芋球莖浸提液混勻，倒平板。

1.5 魔芋根際土壤浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2019年6月22日在陜西省漢中市南鄭區三花石村魔芋病害生防試驗田中,采用五點取樣法和抖根法[13]分別采集同一田塊未種植作物的閑置農田土壤、第1年和連作2年的魔芋根際土壤各5份,在自然風干、去雜后，研磨過0.25 mm土壤篩。各處理分別稱取混合土樣100 g，加入到100 mL蒸餾水中，浸泡48 h,然后以5000 r/min離心3 min，棄沉淀,重復2次；將上清液定容至100 mL,得到1 g/mL母液；母液用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，然后于4 ℃冰箱保藏備用[14]。取不同處理的土壤浸提液母液，添加至滅菌后冷卻至60 ℃左右的PDA培養基中,分別配制含稀釋5、10、50和100倍土壤浸提液的PDA培養基,以不添加土壤浸提液的PDA培養基為對照(CK)；PDA培養基與土壤浸提液混勻后倒平板。

在1.4和1.5節中的各處理供試平板制備完成后,將1.2節制備的病原菌菌餅置于平板中央,在28 ℃下培養10 d,各處理重復3次。

1.6 齊整小核菌生長狀況觀察及菌落與微菌核區面積測定

上述各處理病原菌平板自第3天起，每24 h觀察記錄生長狀況1次;采用十字交叉法[15]測量病原菌菌落直徑W,根據公式(1)和(2)分別計算病原菌菌絲的相對生長速率(mm/d)和絕對生長速率(mm/d)[16]:

相對生長速率=(lnWt+1-lnWt)/?t

(1)

絕對生長速率=(Wt+1-Wt)/?t

(2)

上式中:Wt+1表示第t+1天測量的菌落直徑(mm);Wt表示第t天測量的菌落直徑(mm);Δt表示兩次測量菌落直徑的時間差(d)。

采用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖片分析,分別測定菌落總面積像素值(colony area pixels, CAP)及微菌核區面積像素值(microselerotia area pixels, MSAP)。根據菌落直徑測量值計算菌落總面積(Colony Area, CA)、微菌核區面積占菌落總面積的比例(Microselerotia Proportion, MSP)及微菌核區面積(Microselerotia Area, MSA)[15]，其計算公式分別為:

CA=π×(D10/2)2

(3)

MSP=MSAP/CAP×100%

(4)

MSA=CA×MSP10

(5)

式中:D10為病原菌在第10天時培養皿反面菌落直徑;MSAP、CAP分別為微菌核區面積、菌落總面積的像素值;MSP10為病原菌在第10天時微菌核區面積占菌落總面積的比例。

1.7 數據處理

利用SPSS 22.0軟件進行方差分析,處理間用Duncan’s法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 培養條件對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.1.1 pH 由表1和圖1A可知,齊整小核菌在pH 5.0～9.0范圍內均可生長,當pH值為7.0時菌絲相對生長速率和絕對生長速率均達到最大,分別為0.274和17.72 mm/d。當pH值升高或降低時菌絲生長有所減慢,表明偏酸性或堿性會影響齊整小核菌菌絲的生長速率,但不同pH值對菌落和微菌核面積的影響不顯著。

2.1.2 營養條件 齊整小核菌在全營養PDA培養基上的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積、微菌核區面積及微菌核區占菌落總面積比例均達到最大,其次為半營養培養基,而在水瓊脂平板上生長最慢且不能形成微菌核,說明營養豐富更有利于齊整小核菌菌絲的生長和微菌核的形成(表1和圖1B)。

2.1.3 光照 由表1和圖1C可以看出,不同光照條件下齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積、微菌核區面積及微菌核區占菌落總面積比例均表現為:連續黑暗>光暗交替>連續光照。其中,在連續黑暗條件下,齊整小核菌微菌核區面積分別較連續光照和光暗交替條件下顯著增加了99.7%和7.1%,表明連續黑暗更有利于齊整小核菌產生微菌核。

A: pH值。B：營養。C：光照。

表1 培養條件對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.2 寄主對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.2.1 魔芋粉 由表2可知,PDA培養基中添加質量濃度為0.5～10 g/L的魔芋粉時,齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區面積隨著魔芋粉質量濃度的升高而逐漸增加；當魔芋粉質量濃度為10 g/L時,齊整小核菌菌落的生長狀況最佳。

2.2.2 魔芋球莖浸提液 由表2可知,在添加稀釋0～50倍魔芋球莖浸提液的PDA培養基中齊整小核菌均可生長,其菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區面積隨著魔芋球莖浸提液稀釋倍數的增加而逐漸降低。

表2 魔芋粉及魔芋球莖浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.2.3 魔芋根際土壤浸提液 由表3可知,齊整小核菌在添加稀釋5～100倍不同連作年限魔芋根際土壤浸提液的PDA培養基中均可生長。在相同種植年限條件下,隨著土壤浸提液稀釋倍數的增加,齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區面積逐漸降低。在相同稀釋倍數條件下,隨著種植年限的增加,齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區面積逐漸增加。土壤連作年限、土壤浸提液稀釋倍數及兩者的交互作用顯著影響齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、微菌核區面積及微菌核區占菌落總面積的比例。

表3 魔芋根際土壤浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

3 討論與結論

白絹病又稱菌核根腐病、南方枯萎病、菌核性苗枯病和油菜籽病。1991年,魔芋白絹病首先在江西省宜黃縣地區發生,隨后陸續在全國魔芋主產區傳播[4]。魔芋白絹病的發生、流行與環境條件密切相關,環境中的光照、土壤營養及pH值等都是關鍵的影響因子。邢夢玉等[18]研究發現,龍血樹白絹病菌齊整小核菌在有無光照條件下都能生長,說明該病菌對環境適應范圍較廣,這與本研究的結果基本一致。通過分析光照對齊整小核菌微菌核形成的影響,發現連續黑暗更有利于其產生微菌核,在連續光照下只能產生少量微菌核,這可能與白光抑制或延遲病原真菌微菌核的形成有關[19]。

崔鳴等[6]研究發現,隨著種植年限的增加,魔芋白絹病逐年加重。即種植年限與魔芋白絹病的發生存在一定的相關性,但目前尚無種植年限對魔芋白絹病菌齊整小核菌微菌核形成影響的報道。土壤作為病原菌侵染植物的主要介質之一,植物根系分泌到土壤中的酚酸等化感物質是很多病原菌的主要能源物質,對病原菌微菌核的形成與活性有重要影響[15,20]。本研究發現,連作年限及魔芋根際土壤浸提液濃度顯著影響齊整小核菌菌絲的生長及微菌核的形成。不同連作年限魔芋根際土壤浸提液稀釋5～100倍時,齊整小核菌均可生長,且隨著土壤浸提液稀釋倍數的增加、連作年限的減少,齊整小核菌菌絲的生長速率、菌落總面積和微菌核區面積亦相應降低。大量研究表明,作物根系分泌物在土壤中殘留并隨著種植年限增加而富集[21-22]。由此推測連作魔芋根際土壤中的根系分泌物,尤其是酚酸等化感物質可能與齊整小核菌微菌核的形成有關,這與其他作物根系分泌物促進其病原菌生長繁殖的結論[22]相似。在逆境生長條件下,微菌核是魔芋白絹病菌主要的存在方式,在無寄主的情況下也能在土壤中維持數年。連作致使魔芋根系分泌物的數量和種類發生了一定程度的變化,這可能導致魔芋根際土壤微生物的種類和數量也發生改變。不同連作年限的魔芋根系分泌物及由分泌物誘導而改變了的根際微生物又會作用于土壤,對土壤營養元素的平衡產生影響,這又會加劇由魔芋對土壤營養元素偏好吸收而造成的營養不平衡,導致魔芋生長發育不良及抗病能力下降,因而造成連作條件下魔芋白絹病發生的風險更大、概率更高,難以防治。因此,在生產實踐中,應盡量采用合理輪作、間作及混種等技術，以便有效減少白絹病菌在魔芋植株殘體和根際土壤中的殘留,使病原菌失去寄主或生活環境惡化,從而有效降低魔芋白絹病的發生率[23]。

夏紅飛等[12]研究表明,寄主根系提取物能誘導棉花黃萎病菌大麗輪枝菌微菌核形成相關基因的表達。本研究發現,一定質量濃度的魔芋粉及球莖浸提液刺激齊整小核菌菌絲生長及微菌核的形成,推測魔芋球莖中的某些成分也可能誘導病原菌菌絲和微菌核形成相關基因的表達。但魔芋球莖營養豐富,包含葡甘聚糖、粗蛋白、游離氨基酸、淀粉、可溶性糖、還原糖、生物堿、多酚氧化酶及神經酰胺等[25]多種成分,魔芋粉和球莖浸提液中具體何種活性成分在發揮作用尚不清楚,其作用機制是誘導齊整小核菌孢子萌發或芽管伸長,還是作用于細胞壁、細胞膜或細胞質等,均有待于通過進一步研究來明確。