石斛無菌播種及培養(yǎng)

王蓮輝

石斛（Dendrobium）屬于蘭科植物，全球約1500種，中國(guó)近80種。生于海拔480～1700米的山地林中樹干上或山谷巖石上，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶，澳大利亞和太平洋島嶼，我國(guó)大部分分布于西南、華南、臺(tái)灣等地。

石斛是世界上著名的觀賞蘭花，具有靚麗的容顏，葉披針形，莖肉質(zhì)稍粗狀，花葶從葉腋抽出，花單朵至數(shù)多不等，每花3萼片和3花瓣，呈喇叭狀散開，色彩斑斕，花型奇特，馥郁芬芳，許多種類還具有極高的藥用價(jià)值。

貴州省林業(yè)科學(xué)研究院在石斛資源收集的基礎(chǔ)上，針對(duì)價(jià)值較高的一些種諸如鐵皮石斛、球花石斛，扭瓣石斛、翅萼石斛、晶帽石斛、金釵石斛、密花石斛、鼓槌石斛等開展了相關(guān)研究。

人工授粉

選取生長(zhǎng)健壯的石斛母株，觀察石斛花苞的生長(zhǎng)狀態(tài)，接近開放時(shí)去雄套袋，待花開5～7天人工授粉，用鑷子摘取成熟且具粘性的花粉粘貼于雌蕊柱頭上，2～3天花瓣閉合，子房膨大，每種石斛果實(shí)成熟期不同。

蒴果采收

無論是昆蟲充當(dāng)媒介還是人工扮演昆蟲的角色，只要授粉成功，歷經(jīng)120～180天的等待，種子孕育初見成效，成熟時(shí)蒴果由硬變軟，顏色由綠變黃即可采收作為外植體。

試驗(yàn)過程

培養(yǎng)基的配制

石斛播種的培養(yǎng)基多種多樣，不同品種的最適培養(yǎng)基不同，有些品種加入天然有機(jī)物時(shí)，能提高種子萌發(fā)率，并加快萌發(fā)速度和生長(zhǎng)速度，這一添加物的運(yùn)用廣泛運(yùn)用。

石斛的培養(yǎng)基采用M S、1/2MS、KC、花寶3號(hào)（3g/L）等為基本培養(yǎng)基，附加細(xì)胞分裂素（6-BA、KT、TDZ等）、生長(zhǎng)素（α-NAA、IAA、IBA等）及天然有機(jī)物（椰乳、香蕉、馬鈴薯、蘋果汁等），所有培養(yǎng)基均按每升葡萄糖30g（生根20g）和瓊脂6g作為固定劑，加熱完全融化，用0.1mol/L的HCl或NaOH調(diào)整pH值在5.2～5.4之間，分裝入培養(yǎng)瓶，每瓶40～50ml，用封口膜或塑料瓶蓋封口，每一處理20～25瓶。

培養(yǎng)基的消毒

由于培養(yǎng)基含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，適宜多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)和繁殖，極易造成污染，影響組培的成功，因此培養(yǎng)基消毒是必不可少的，常用的消毒一般采用高溫高壓消毒法，將盛裝一定量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放置于蒸氣高壓滅菌鍋內(nèi)，設(shè)定1.05kg/ cm的壓力，溫度121.3℃，維持20～30min，室溫冷卻后待用。

無菌材料的獲得及播種

由于石斛胚發(fā)育不完全，在自然狀態(tài)下繁殖困難，需與真菌共生才能發(fā)芽，存在種子萌發(fā)率低，成苗率低的問題，因此不能像其他植物一樣在大田或苗床上播種，因此可運(yùn)用生物技術(shù)手段在添加各種營(yíng)養(yǎng)素的無菌培養(yǎng)基上，采用蘭花的無菌播種與試管快速成苗技術(shù)促進(jìn)其萌發(fā)生長(zhǎng)成苗，在短時(shí)間內(nèi)滿足大規(guī)模種植種植需求。

無菌播種：建立無菌培養(yǎng)物的過程如下，首先要進(jìn)行外植體的表面滅菌，待石斛果實(shí)成熟未開裂時(shí)，剪取果實(shí)放在自來水下沖洗表面的臟物2～3小時(shí)，將上下兩端切除，置于超凈工作臺(tái)上。選用飽滿的果實(shí)用75%的酒精浸泡20-30秒，再用5%～10%次氯酸鈉（NaClO）處理10分鐘，最后用0.1%升汞（HgCl2）消毒5分鐘，或3%雙氧水溶液消毒 5～20分鐘，以無菌水沖洗數(shù)4～5次。

在操作前準(zhǔn)備好所有滅菌工具，保持超凈工作臺(tái)的無菌狀態(tài)，用無菌濾紙擦干果實(shí)后，用解剖刀剝開果皮，用接種針將黃色粉末狀胚均勻地撒播于培養(yǎng)基上，播種密度以每瓶數(shù)量大致能接觸到培養(yǎng)基為宜，太密時(shí)會(huì)影響發(fā)芽率及發(fā)芽后的正常生長(zhǎng)，播種后稍加振動(dòng)，使種子充分散布于培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)條件：試驗(yàn)材料的各種培養(yǎng)是在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行的，溫度維持在23～25℃。將播種后的玻璃瓶放置于帶有兩支40W日光燈的培養(yǎng)架上，光照強(qiáng)度30～40μmol.m-2.s-1，時(shí)間12h. d-1，溫度過高易褐變死亡，溫度過低發(fā)芽慢。

原球莖培養(yǎng)：石斛種子在所配制的MS或1/2MS添加α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培養(yǎng)基上，接種2～3周胚明顯增大，形成白色原球莖，4～5周原球莖轉(zhuǎn)綠，7～8周種胚突破種皮，部分頂端出現(xiàn)綠色葉原基，球體基部有絲狀毛。

增殖培養(yǎng)：為獲得更多的種苗，將混合有葉原基和原球莖的組織接種于MS或1/2MS添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）1-3mg/L及α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培養(yǎng)基上，3～5周，原球莖伸長(zhǎng)長(zhǎng)大，葉片從原球莖頂部生出，7-9周第2及第3片葉長(zhǎng)出并呈3～5株的叢生帶短根的小苗。

壯苗生根：隨著幼苗的生長(zhǎng)，分瓶移入另外的培養(yǎng)基中，給予充足的生長(zhǎng)空間，形成能用于栽培的植株。將長(zhǎng)成的叢生植株分開接種到1/2MS或1/4MS添加吲哚乙酸（IBA）0.05～0.5mg/L及α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培養(yǎng)基上，一般每瓶接種15株左右，經(jīng)5～7周幼根長(zhǎng)長(zhǎng)，8～10周長(zhǎng)成具2-3條根、3～4片葉的完整植株。

練苗及移栽：基質(zhì)選擇：通過查閱有關(guān)資料及多年從事組培小苗的培育經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合石斛的生長(zhǎng)習(xí)性對(duì)基質(zhì)的要求（疏松、透氣、排水），選擇石斛組培苗煉苗基質(zhì)以碎樹皮+植金石+水苔等混合為宜。

基質(zhì)消毒：用高錳酸鉀1000倍液對(duì)所選基質(zhì)進(jìn)行消毒處理，并放置于太陽下進(jìn)一步爆曬，裝育苗盤待用。

當(dāng)石斛小苗長(zhǎng)到3～5cm時(shí)，可移出培養(yǎng)瓶。出瓶前在溫室中的自然光照下煉苗7天，然后將其從玻璃瓶中取出，用水輕輕清洗根部的培養(yǎng)基，用鑷子栽于育苗盤中，每盤120叢，而后放在25℃左右的溫室內(nèi)，保持較高的空氣濕度和較強(qiáng)的散射光，每周施一次液面肥并噴灑抗菌劑，2個(gè)月后可按常規(guī)的日常管理即可。