多花黃精花粉萌發(fā)與傳粉生物學(xué)特性*

李緒杰，盛雅娟，張彤，吳瀅，解孟康，熊武建，廖文波，李曉紅

1. 重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室/安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖 241000

2. 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275

3. 上海市城市化生態(tài)過程與生態(tài)恢復(fù)重點實驗室/華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200241

多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 是天門冬科Asparagaceae 黃精屬Polygonatum多年生草本植物，具有藥用、食用、觀賞等多種經(jīng)濟價值，為《中華人民共和國藥典》（2020年版）規(guī)定3種藥用黃精的基源植物之一［1］。黃精是我國傳統(tǒng)中草藥，最早記載于《名醫(yī)別錄》中，《證類本草》《本草綱目》《本草圖經(jīng)》等也有記載［2］，藥用歷史悠久。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認為黃精味甘平，具有補中益氣、健脾潤肺、益腎填精等功效。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究證明，黃精具有很好的調(diào)節(jié)血糖血脂、提高機體免疫力、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老等功效［3-6］。面對藥材黃精市場的大量需求和野生資源的日漸枯竭，人工栽培多花黃精以滿足市場需要已是勢在必行。但目前多花黃精栽培主要以根狀莖進行無性繁殖，不利于野生種群的遺傳變異和栽培品種的優(yōu)質(zhì)化，且易引起藥材品質(zhì)退化，植株易感病蟲害等問題［7-8］。多花黃精的有性繁殖栽培是滿足市場需求和保護多花黃精野生資源的可持續(xù)發(fā)展之路。

在顯花植物的有性繁殖栽培中，進行人工授粉需要保證花粉的活力及柱頭的可授性。花粉活力測定方法多樣，其中花粉離體萌發(fā)法是最真實可靠的檢測花粉活力的方法［9］。花粉包含了高等植物的遺傳信息，是植物種質(zhì)資源庫和基因庫保存的重要材料，對花粉離體萌發(fā)條件的研究，有助于優(yōu)化花粉的低溫貯藏方法［10］。關(guān)于多花黃精種苗繁育的研究有很多［11-12］，但對其傳粉生物學(xué)的研究報道較少，僅劉佳等［13］對云南金平種植基地的多花黃精的傳粉方式進行研究，另有學(xué)者對重慶市和浙江省移栽的多花黃精生殖生物學(xué)進行研究［14-15］，安徽省地區(qū)多花黃精傳粉生物學(xué)尚無系統(tǒng)性報道，前人均采用TTC 法測定多花黃精花粉活力，有關(guān)多花黃精的離體花粉萌發(fā)條件探究及花粉活力測定方法的比較研究未見報道。因此，本文以移栽自安徽省九華山地區(qū)的多花黃精為實驗材料，對其花粉萌發(fā)條件進行試驗探究，為花粉離體萌發(fā)法測定花粉活力提供理論支撐，同時對多花黃精的傳粉生物學(xué)特性進行研究，以補全安徽省地區(qū)多花黃精傳粉生物學(xué)研究資料，并為九華黃精的人工授粉提供建議。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗地概況

實驗材料來自于蕪湖安徽師范大學(xué)同質(zhì)園（118°22'30.63″N， 31°20'9.92″E）移栽的多花黃精。研究所用的多花黃精為根狀莖繁殖，移栽2 年，種莖來自安徽省池州市九華山地區(qū)（117°51'26.66″N， 30°33'43.17″E）。蕪湖市位于安徽省東南部，地處長江下游，地理坐標(biāo)介于東經(jīng)117°40'～118°44'、北緯30°19'～31°34'，該地區(qū)為亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫為15～16 ℃，日照時數(shù)約2 000 h，年降雨量約為1 200 mm，但年內(nèi)降水分布不均，主要集中在春季、梅雨季節(jié)和初冬，無霜期每年達219～240 d。

1.2 開花物候觀測

開花物候觀測為2019 年5 月1 日至5 月28 日。單株觀測：觀察隨機選定的7株多花黃精從第1朵花開放到最后1朵花凋謝的變化。記錄始花期、終花期和花期持續(xù)時間。花序觀測：隨機選擇7株花朵即將開放的多花黃精，每株分別隨機標(biāo)記5個花序，開花后每日統(tǒng)計各花序上新增開花數(shù)、花的開放順序、花序開放的持續(xù)時間。單花觀測：隨機標(biāo)記35 朵單花，記錄單花開放的時間，同時觀察其形態(tài)變化。開花振幅、同步指數(shù)計算方法：開花振幅代表所標(biāo)記植株花序上單位時間的開花數(shù)，采用“花數(shù)·株-1·d-1”來表示；同步指數(shù)用Si表示，用于檢測開花同步性高低

式中ej表示個體i和j花期重疊時間（d），fi表示個體i開花的總時間（d），n表示樣地中個體總數(shù)。Si的變異范圍為0～1，0表示種群內(nèi)個體花期無重疊，1則表示完全重疊［16］。

1.3 花粉萌發(fā)條件探究

采用懸滴培養(yǎng)法，將不同開花時期的花粉與培養(yǎng)液充分混勻，在蓋玻片中央滴入0.1 mL 的培養(yǎng)液，然后將其覆蓋在單凹孔型載玻片上，使培養(yǎng)液液滴對準(zhǔn)凹孔中央，蓋玻片四周用凡士林封閉。將載玻片放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率；花粉管長度大于等于花粉粒直徑即認為其已萌發(fā)，每組處理制作3 枚載玻片作為3 次重復(fù)，每張載玻片隨機觀察3個視野，每個視野統(tǒng)計不少于30 粒花粉，若視野中花粉粒不足30 粒，則更換視野統(tǒng)計（圖1）。

圖1 懸滴培養(yǎng)法的花粉萌發(fā)率統(tǒng)計花粉管長度大于花粉粒直徑視為已萌發(fā)。Fig.1 Statistics of pollen germination rate in hanging drop culture method

花粉萌發(fā)率=（萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉總數(shù)）×100%。

1.3.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2單因子試驗以多花黃精盛花期花朵的花粉為試驗材料。蔗糖質(zhì)量濃度梯度為50、100、150、200 g/L；H3BO3質(zhì)量濃度梯度為50、100、200、300 mg/L； CaCl2質(zhì)量濃度梯度為50、150、250、350 mg/L。用懸滴培養(yǎng)法進行花粉萌發(fā)試驗，每組處理重復(fù)3 次，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，篩選出多花黃精花粉萌發(fā)的適宜蔗糖、H3BO3和CaCl2質(zhì)量濃度。

1.3.2 蔗糖、H3BO3、CaCl2正交試驗以多花黃精盛花期花朵的花粉為試驗材料。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確立蔗糖、H3BO3和CaCl2的質(zhì)量濃度范圍及梯度，進行L16(43)正交試驗（表1）以尋求最佳的培養(yǎng)基配方，每組處理重復(fù)3次。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 化學(xué)染色法檢測花粉活力的比較

以多花黃精盛花期花朵的花粉為試驗材料，采用I2-KI 染色法［17］、MTT 染色法［18］和TTC 染色法［19］分別測定花粉活力，對結(jié)果進行比較分析，篩選出最適宜的多花黃精花粉活力的檢測方法。

1.5 花粉活力及柱頭可授性測定

采集花蕾期、含苞期、始花期、盛花期和枯萎前、后期6個時期的新鮮花朵（圖2），將適量花粉與最適濃度的培養(yǎng)液混合，用懸滴培養(yǎng)法置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，之后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計視野中萌發(fā)花粉粒所占比例。

圖2 不同開花時期的多花黃精花朵Fig.2 The flowers of Polygonatum cyrtonema in different flowering stages

配制體積比為φ=1%聯(lián)苯胺∶φ=3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液，采集花蕾期、含苞期、始花期、盛花期和枯萎前、后期6個時期的新鮮花朵，將各時期花朵的柱頭置于滴有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液的凹面載玻片中，使反應(yīng)液浸沒柱頭，若柱頭呈現(xiàn)藍色并且周圍反應(yīng)液產(chǎn)生大量氣泡，則說明柱頭具有可授性，依據(jù)柱頭染色深淺和氣泡數(shù)量判斷柱頭可授性強弱。

1.6 傳粉昆蟲調(diào)查

調(diào)查時間為2019 年5 月11 日～5 月17 日，每天分8:00～10:00、12:00～14:00、15:00～17:00三個時間段進行。在同質(zhì)園劃分出多花黃精生長狀況相近的南北兩塊區(qū)域（面積各約20 m2，相距約8 m），采用實時追蹤法［20］和定時定點觀察法相結(jié)合的調(diào)查方法對南北兩個區(qū)域同時進行多花黃精傳粉昆蟲觀察，記錄昆蟲訪花時間、訪問次數(shù)和傳粉行為。

1.7 自然結(jié)實率統(tǒng)計

在同質(zhì)園隨機選定15 株多花黃精，對各植株的開花數(shù)和結(jié)實數(shù)進行監(jiān)測，統(tǒng)計其自然結(jié)實率。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 進行單因素方差（ANOVA）分析，并用Duncan（α=0.05）分析法對數(shù)據(jù)進行多重比較。統(tǒng)計分析和制圖通過Excel 2007實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花黃精開花物候

2.1.1 單株開花物候多花黃精每年開花1 次，花期為4月末至6月初，盛花期在5月中旬。由表2可見，花期持續(xù)時間為（10.57 ± 2.19） d（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，N=7），花期同步指數(shù)為0.81±0.12，說明多花黃精在單株水平上具有較高的開花同步性。

表2 多花黃精單株花期和花期同步指數(shù)Table 2 Flowering duration and synchronization index of Polygonatum cyrtonema individual plant

2.1.2 花序水平開花物候多花黃精的花為傘形花序，黃綠色，每個花序上有2～8朵小花，花蕾與花的產(chǎn)生和開放是從基部向上、按順序的，枝條下部的花先開，位于枝條上部的花隨后開放（圖3）。多花黃精花序開花持續(xù)時間為（5.37 ±2.24） d（平均差±標(biāo)準(zhǔn)差，N=35）。由圖4 可知，花序開花物候進程為多峰曲線式樣，始花后第6天開花數(shù)量達到最高值。根據(jù)花序持續(xù)時間分布頻率的統(tǒng)計結(jié)果（圖5），多花黃精的花序開放持續(xù)時間的頻率分布多為2～7 d，約占總體的73%。

圖3 多花黃精開花順序由基部花序向上開放Fig.3 Polygonatum cyrtonema open its flower from the base inflorescence

圖4 多花黃精花序水平的開花振幅Fig.4 Amplitude of inflorescence in Polygonatum cyrtonema

圖5 多花黃精的花序開放時間頻率分布Fig.5 Inflorescence flowering duration frequency distribution of Polygonatum cyrtonema

2.1.3 單花開放進程多花黃精單花花期為（2.20 ± 0.82） d（平均差± 標(biāo)準(zhǔn)差，N=35），單花開放的第1天上午10：00，花朵形態(tài)飽滿正常，花被前端開始張開，花被片前端形成6枚裂片。第2 天上午10：00，花被前端完全張開，花朵形態(tài)更加飽滿，花被裂片向后卷曲。第3 天上午10：00，單花的花被裂片開始萎蔫，顏色逐漸變?yōu)楹稚?/p>

2.2 多花黃精花粉萌發(fā)條件

2.2.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2單因子對多花黃精花粉萌發(fā)的影響蔗糖單因素實驗結(jié)果表明（圖6），多花黃精的花粉在50 ～100 g/L 的蔗糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度的增加而提高，在100～200 g/L 的蔗糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度的減少而降低；當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為100 g/L 時，花粉萌發(fā)率達到最高，為69.46%。因此，多花黃精花粉萌發(fā)的適宜蔗糖質(zhì)量濃度為100 g/L。

H3BO3單因素實驗結(jié)果表明（圖6），當(dāng)H3BO3質(zhì)量濃度在50～200 mg/L 的范圍時，多花黃精的花粉萌發(fā)率基本穩(wěn)定，在H3BO3質(zhì)量濃度為100 mg/L時，花粉萌發(fā)率達到最高，為56.32%，當(dāng)H3BO3質(zhì)量濃度超過200 mg/L 后，花粉萌發(fā)率急劇下降。因此，多花黃精花粉萌發(fā)的適宜H3BO3質(zhì)量濃度范圍為50～200 mg/L。

CaCl2單因素實驗結(jié)果表明（圖6），當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度為50～250 mg/L 時，多花黃精的花粉萌發(fā)率隨CaCl2質(zhì)量濃度的增加而提高，在CaCl2質(zhì)量濃度為250 mg/L 時，花粉萌發(fā)率達到最高，為43.75% 。當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度超過250 mg/L 時，花粉萌發(fā)率開始下降。因此，多花黃精花粉萌發(fā)的適宜CaCl2質(zhì)量濃度為250 mg/L。

圖6 不同蔗糖、H3BO3、CaCl2質(zhì)量濃度下多花黃精花粉的萌發(fā)率（N=3）不同字母表示顯著性差異（P＜0.05）。Fig.6 Pollen germination rate of Polygonatum cyrtonema in different sucrose,boric acid,calcium chloride concentrations(N=3)

2.2.2 蔗糖、H3BO3、CaCl2三因子L16（43）正交試驗結(jié)果正交試驗結(jié)果表明（表3）：用直觀分析法分析所得數(shù)據(jù)，極差分析顯示蔗糖、H3BO3、Ca2+這三個因素對多花黃精花粉萌發(fā)的影響程度由大到小的順序為：蔗糖、CaCl2、H3BO3。即蔗糖質(zhì)量濃度是決定花粉萌發(fā)率的最關(guān)鍵因素，其次是CaCl2質(zhì)量濃度，H3BO3質(zhì)量濃度的影響效果最小。

表3 多花黃精花粉正交試驗的萌發(fā)率1）Table 3 Germination rate of Polygonatum cyrtonema pollen in orthogonal test

分析不同因素水平對多花黃精花粉萌發(fā)率的影響，每個因素取其平均值的最高水平，組合后得到最適宜培養(yǎng)基配方為A3B3C3，即150 g/L 蔗糖+200 mg/L H3BO3+250 mg/L CaCl2。

在這個最優(yōu)組合中，CaCl2和H3BO3的適宜質(zhì)量濃度與單因子試驗結(jié)果一致，而蔗糖的適宜質(zhì)量濃度與單因素試驗結(jié)果有差別。正交試驗得出蔗糖適宜濃度為15%，單因子試驗得出的適宜濃度是10%，在蔗糖單因子試驗中，蔗糖濃度為10%

和15%時的花粉萌發(fā)率具有顯著差異，二者結(jié)果的差別可能是因為不同因素之間對多花黃精花粉萌發(fā)的影響具有協(xié)同作用，導(dǎo)致各個最優(yōu)的單因素條件搭配起來并非最適宜多花黃精花粉萌發(fā)的配方。

2.3 I2-KI、MTT、TTC化學(xué)染色法的比較

3 種化學(xué)染色法測定多花黃精花粉活力的結(jié)果如表4 所示。I2-KI 染液處理后經(jīng)過長時間的染色，花粉粒仍難以著色，顏色差異不顯著，無法明確區(qū)分出是否具有活力，因此I2-KI 染色法不能測定多花黃精的花粉活力。MTT 染色法和TTC 染色法都能法能夠在短時間內(nèi)使花粉明顯著色（圖7），但MTT 染色法在枯花期測得的結(jié)果偏高，原因是染色后花粉的顏色差別很小，大多是較深的藍紫色，不易分辨，導(dǎo)致測定值偏高，另外該方法與萌發(fā)測定不相關(guān)［20］。因此TTC 染色法是快速有效測定多花黃精花粉活力的方法。

表4 MTT與TTC染色法測定不同時期花粉活力Table 4 Comparison of pollen viability in different stages by MTT and TTC staining%

圖7 MTT（a）與TTC（b）染色法花粉活力測定效果Fig.7 Effects of MTT(a)and TTC(b)staining methods on pollen vitality determination

2.4 多花黃精花粉活力與柱頭可受性

通過懸滴培養(yǎng)法進行花粉萌發(fā)實驗（表5）發(fā)現(xiàn)，多花黃精在含苞期開始出現(xiàn)花粉活力，并隨著花藥的開裂花粉活力逐漸上升，在盛花期達到最高，花粉活力在始花期到盛花期階段比較穩(wěn)定，此后花粉活力隨著開花后花粉的散失逐漸下降，至枯萎后期花粉活力幾乎喪失。

表5 不同開花時期多花黃精的花粉活力Table 5 The pollen viability of Polygonatum cyrtonema in different flowering periods

通過聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測多花黃精柱頭可授性（表6），結(jié)果表明：多花黃精在花蕾期柱頭顏色無明顯變化，周圍無氣泡產(chǎn)生，表明其不具有可授性，見圖8（a）；含苞期柱頭周圍開始產(chǎn)生少量氣泡，柱頭顏色微微變藍，表明該時期柱頭開始具有可授性，但是可授性較弱，見圖8（b）；始花期柱頭周圍產(chǎn)生較多氣泡，柱頭顏色變藍，相比含苞期，其柱頭可授性明顯增強，見圖8（c）；盛花期柱頭顏色變深藍，柱頭周圍產(chǎn)生大量氣泡，表明該時期多花黃精的柱頭可授性最強，見圖8（d）；枯萎前期部分柱頭顏色無明顯變化，柱頭周圍有少量氣泡產(chǎn)生，表明該時期柱頭可授性開始減弱，見圖8（e）；枯萎后期柱頭顏色無變化，少部分柱頭周圍有極少量氣泡產(chǎn)生，大部分柱頭周圍無氣泡產(chǎn)生，表明該時期的柱頭可授性逐漸消失，見圖8（f）。

表6 不同開花時期多花黃精的柱頭可授性1）Table 6 The stigma receptivity of Polygonatum cyrtonema in different flowering periods

圖8 不同時期的多花黃精柱頭可授性變化Fig.8 Changes of stigma receptivity of Polygonatum cyrtonema in different flowering periods

2.5 訪花昆蟲及其訪花行為

2.5.1 訪花昆蟲種類和行為訪花昆蟲種類(圖9)

圖9 3種訪花昆蟲Fig.9 Three species of pollinating insects

主要有中華蜜蜂Apis cerana、黑帶食蚜蠅Episyr?phus balteatus、熊蜂Bombus latreille等。

訪花行為：中華蜜蜂訪花前會先在空中盤旋，之后落在某一株植株上開始訪花，訪問第一朵花后，順著莖向兩側(cè)連續(xù)訪問其他的花朵，當(dāng)?shù)谝恢曛仓暝L問完畢后常會跳躍飛行到臨近的其他植株上繼續(xù)訪問。訪花時直接落到花朵上，用后足抱握花被，中足和前足迅速收集花粉，在采集花粉過程中會轉(zhuǎn)動身體、后足來更換著力點；黑帶食蚜蠅訪花時直接落到花被上，采集花粉時頭部會伸入花腔，直接伸出喙舐食花粉，同時用兩前足來回搓動花粉，偶爾用2 前足刷頭部或2 前足之間相互刮刷來將頭部及前足粘有的花粉送到口器，尾部常有節(jié)奏地上下擺動；熊蜂在接近花朵時，前足先接觸花瓣并懸空震動翅膀，使成熟花粉釋放出來粘在熊蜂的前足、頭部及前胸部，之后中足和后足會交叉刮刷，將粘附的花粉收集到花粉籃中，動作幅度一般較大，常會引起相鄰近的花朵隨之晃動。

2.5.2 傳粉昆蟲訪花習(xí)性

1) 傳粉昆蟲累計訪花次數(shù)。多花黃精傳粉昆蟲連續(xù)7 d 的累計訪花次數(shù)如表7 所示。中華蜜蜂的累計訪花次數(shù)遠大于黑帶食蚜蠅和熊蜂的累計訪花次數(shù)，由此可推斷，中華蜜蜂是多花黃精主要的傳粉昆蟲。

表7 傳粉昆蟲累計訪花次數(shù)1）Table 7 The cumulative number of pollinating insects

2) 不同時間段傳粉昆蟲訪花次數(shù)。5 月11 日至5 月17 日連續(xù)7 d 對傳粉昆蟲訪花次數(shù)與每日最高溫度進行了統(tǒng)計分析（圖10），多花黃精傳粉昆蟲在5 月11 日訪花最多，訪花次數(shù)為79 次，在5月15 日最少，僅22 次，昆蟲訪花次數(shù)與日最高溫度變化呈正相關(guān)。在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度的升高會促進花香等化學(xué)物質(zhì)的揮發(fā)，進而提高昆蟲的傳粉效率。

圖10 傳粉昆蟲訪花次數(shù)與日最高溫度趨勢Fig.10 The trend of pollinating insects and daily maximum temperature

3) 傳粉昆蟲的每日訪花時間。傳粉昆蟲每日訪花時間如表8所示，中華蜜蜂在南區(qū)的訪花時間為(1.45± 0.55) min（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，N=7），在北區(qū)則為(3.02±1.31)min（N=7）；熊蜂的訪花時間在南區(qū)為(7.53 ± 5.57) min（N=3），在北區(qū)為1.78 min（N=2）；黑帶食蚜蠅在南區(qū)的訪花時間為0.48 min（N=1），在北區(qū)為(11.79 ± 9.43) min（N=2）。熊蜂和食蚜蠅由于觀測數(shù)據(jù)較少，數(shù)值波動較大。在7 d 的傳粉昆蟲觀測中，均有中華蜜蜂進行訪花。中華蜜蜂在日溫度較高的5 月11 日、5月17 日的訪花時間明顯長于日溫度較低的5 月14日、5月15日，說明溫度對傳粉昆蟲訪花時長有重要影響。

表8 傳粉昆蟲每日訪花時間Table 8 Daily visiting time of pollinating insectsmin

2.6 多花黃精自然結(jié)實率統(tǒng)計

通過對多花黃精的開花數(shù)和結(jié)實率進行觀測記錄，15 個植株共開花384 朵，結(jié)實178 顆，自然結(jié)實率為46.35%。部分植株開花和結(jié)果時受到天氣變化、動物行為等外界環(huán)境因素影響，導(dǎo)致落花落果嚴重。

3 結(jié)論與討論

3.1 多花黃精花粉萌發(fā)條件

花粉萌發(fā)情況直接反映了花粉活力的高低，對于花粉萌發(fā)條件的探究，有助于貯藏花粉，為檢測花粉的真實活力提供方法。不同植物之間的花粉的萌發(fā)條件不同，存在明顯差異性。目前對多花黃精花粉萌發(fā)條件的探究實驗未見報道。黃精屬玉竹Polygonatum odoratum離體花粉萌發(fā)的培養(yǎng)液為w為10%蔗糖+ 100 mg/L H3BO3+ 300 mg/L Ca(NO3)2+ 200 mg/L MgSO4+ 100 mg/L KNO3［21］。本試驗探究了蔗糖、H3BO3和Ca2+等因素對多花黃精離體花粉萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，適量質(zhì)量濃度的蔗糖、H3BO3和Ca2+能有效促進離體花粉萌發(fā)，萌發(fā)的最適蔗糖質(zhì)量濃度為150 g/L，最適H3BO3質(zhì)量濃度為200 mg/L，最適CaCl2質(zhì)量濃度為250 mg/L。除蔗糖、H3BO3和Ca2+等因素外，Mg2+、K+、培養(yǎng)溫度和光照條件對離體花粉的萌發(fā)也有一定影響，仍需進一步實驗探究。

3.2 化學(xué)染色法測花粉活力比較

植物花粉活力測定方法有TTC 染色法、I2-KI染色法、MTT 染色法、苯胺藍染色法、離體培養(yǎng)基法和懸滴培養(yǎng)法等［22-23］。化學(xué)染色法具有操作便捷，反應(yīng)時間短等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于花粉活力檢測，但由于不同植物花粉體內(nèi)的酶活力不同，不同化學(xué)染色試劑測定花粉活力的效果也存在差異性，本試驗對I2-KI、MTT、TTC 三種化學(xué)染色法效果進行了比較，發(fā)現(xiàn)TTC 染色法是快速、準(zhǔn)確地檢測多花黃精花粉活力的方法。

3.3 傳粉生物學(xué)特性

安徽蕪湖多花黃精開花從5 月8 日開始，5 月26 日結(jié)束，花開放時間為18 d，其單株、花序和單花水平的花期依次為8～13、3～7、1～3 d；單株水平上花期同步指數(shù)為0.81±0.12。貴州多花黃精開花從5 月5 日開始，5 月25 日結(jié)束，花開放時間為20 d［8］；云南金平多花黃精開花從4 月29 日開始，5 月4 日結(jié)束，花開放時間平均為13.6 d［13］。不同地區(qū)的多花黃精開花物候存在差異，這可能與地理位置所造成的溫度、相對濕度和光照強度等外界環(huán)境因子有關(guān)。多花黃精的花粉活力和柱頭可授性總體變化趨勢相吻合，均在含苞期出現(xiàn)活力，在盛花期達到最高值，至枯萎后期消失，這保障了多花黃精有性生殖的順利進行，其與劉艷等［14］對多花黃精花粉活力和柱頭可授性的研究結(jié)果基本相同。多花黃精在自然狀態(tài)下主要依靠中華蜜蜂、熊蜂和黑帶食蚜蠅等昆蟲進行傳粉，昆蟲種類較少且其訪花效率受溫度等環(huán)境因素影響，提高多花黃精的蟲媒傳粉效率需對傳粉昆蟲的生境進行保護。多花黃精自然結(jié)實率為46.35% ，明顯高于劉艷等［14］17.46% 的結(jié)實率，略低于劉佳等［13］報道的60.00%和李立格等［15］報道的65.12%，其存在一定的落花落果現(xiàn)象，對于多花黃精落花落果現(xiàn)象的生物學(xué)研究有利于在生產(chǎn)上提高結(jié)實率，有待后期研究發(fā)現(xiàn)。

3.4 人工授粉建議

基于上述的花粉活力和柱頭可授性數(shù)據(jù)，多花黃精的最佳授粉時期為始花期（開花第1 天）和盛花期（開花第2～3 天）。在九華黃精的育種栽培中，建議采集開花第1 天（花朵剛開放，花藥開裂，尚未開始散粉）的花粉對開花第2～3天（花朵完全開放，柱頭分泌黏液）的柱頭進行人工授粉。