3-[2-(5-溴-噻吩基)]-1-苯基-2-丙烯酮與牛血清白蛋白的相互作用*

王會(huì)鎮(zhèn)，雷琴，張弛翔，姚小軍，陳紹玲，劉家琴，王琰

1. 西華大學(xué)理學(xué)院，四川成都 610039

2. 蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 730000

血清白蛋白在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，與生命體內(nèi)環(huán)境的變化密切相關(guān)［1］。近幾十年來，藥物與血清白蛋白的相互作用引起了研究者的高度關(guān)注［2-4］。本研究的內(nèi)容有助于探究影響藥物治療效果的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)新藥的研發(fā)及設(shè)計(jì)具有很好的指導(dǎo)意義。由于牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）在結(jié)構(gòu)上具有相似性，因此BSA 已被廣泛用于研究蛋白質(zhì)與藥物相互作用機(jī)理［5］。查爾酮可作為類黃酮和異黃酮的前體，廣泛存在于可食用植物中，且已被證明具有多種藥理活性［6-7］。3-[2-(5-溴-2-噻吩基)]-1-苯基-2-丙烯酮（BTPPO，圖1）是一種帶有噻吩基團(tuán)的新型查耳酮衍生物，其與BSA 的相互作用機(jī)理尚未得到深入研究。

本文中，我們?cè)谀M生理環(huán)境下，使用光譜分析法研究了BTPPO 與BSA 的相互作用以及幾種金屬離子的影響。研究了淬滅機(jī)理，結(jié)合力類型以及BTPPO 對(duì)BSA 構(gòu)象的影響。得到了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合距離等數(shù)據(jù)。此外，還使用分子對(duì)接模擬研究了BTPPO 和BSA 之間的相互作用。以上研究有助于闡明BTPPO 與BSA 相互作用的機(jī)制，并為進(jìn)一步研究藥物作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1 原料

牛血清白蛋白（組分V，φ=99%，Sigma 公司）溶于Tris-HCl（pH = 7.40）緩沖溶液中制成1.54×10-5mol?L-1的母液；BTPPO 為實(shí)驗(yàn)室合成，溶于Tris-HCl 緩沖溶液中制成4.53×10-5mol?L-1的母液；Cu2+，Co2+，Pb2+，Ag+，Hg2+，Cd2+金屬離子溶于Tris-HCl 緩沖溶液制成濃度為4.53×10-5mol?L-1的溶液。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器

熒光分光光度計(jì)（F-4600，日立，日本）；紫外可見分光光度計(jì)（CARY 100，安捷倫，美國(guó)）；數(shù)字式pH計(jì)（pHS-25，雷磁，上海）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BTPPO的合成將5 mmol苯乙酮溶于10 mL乙醇中，加入5 mLw=10%的氫氧化鈉溶液，之后加入5 mmol 5-溴-噻吩-2-甲醛，室溫下攪拌8 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入200 mL 去離子水，之后用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為6.8～7.2。過濾得沉淀，之后用乙醇重結(jié)晶得白色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率：80%。合成路線如圖1所示。

圖1 BTPPO的合成路線Fig.1 Synthesis of BTPPO

1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:7.0(d,J=3.9 Hz,1H ),7.1 ( d,J=3.6 Hz, 1H ) , 7.2 ( d,J= 15.3 Hz,1H),7.5(t,J=7.3 Hz,2H),7.6(d,J=7.2 Hz,1H),7.8(d,J=15.3 Hz,1H),8.0(d,J=7.5 Hz,1H)。

1.3.2 光譜研究方法在紫外-可見光譜（UV-vis）的測(cè)試中，設(shè)定光譜測(cè)量范圍為200～400 nm。在熒光光譜測(cè)試中，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300～450 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫的寬度均設(shè)定為5 nm。具體方法為：移取1.54×10-5mol?L-1的BSA 母液3 mL 于石英比色皿中，測(cè)定其發(fā)射光譜，然后用微量進(jìn)樣器逐次加入4.53×10-5mol?L-1的BTPPO母液進(jìn)行熒光滴定。所有實(shí)驗(yàn)均在3 個(gè)不同的溫度（293、310、318 K）下進(jìn)行。然后將激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間隔（Δλ）設(shè)置為15 nm和60 nm，進(jìn)行同步熒光光譜測(cè)量。

通過以下公式進(jìn)行了熒光強(qiáng)度值的校正以消除內(nèi)部濾鏡效果的影響［8］

其中Fcor和Fobs分別是熒光強(qiáng)度校正值和測(cè)量值；Aex和Aem分別是BTPPO-BSA 體系在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下的吸光度。

1.3.3 分子對(duì)接模擬首先使用Schr?dinger 2009

軟件中的2D Sketcher 構(gòu)建了BTPPO 的分子結(jié)構(gòu)模型。然后在OPLS-2005 力場(chǎng)中使用LigPrep 連接酶對(duì)BTPPO 進(jìn)行預(yù)處理，并計(jì)算出化合物低能量狀態(tài)下的3D 構(gòu)象異構(gòu)體［9-10］。使用Epik 技術(shù)［11］在7.0±2.0 的pH 值下進(jìn)行了離子化狀態(tài)分布。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB ID 代碼4OR0）［12］檢索到BSA 的3D 晶體結(jié)構(gòu)用于分子對(duì)接模擬。使用蛋白質(zhì)制備向?qū)コY(jié)晶水分子的影響并進(jìn)行氫原子的添加。使用OPLS-2005 力場(chǎng)進(jìn)行部分電荷的分配［10］，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)子化狀態(tài)分配。當(dāng)均方根偏差（RMSD）達(dá)到最大值0.30 時(shí)，終止最小化。使用Glide［13］在標(biāo)準(zhǔn)精度（SP）下進(jìn)行分子對(duì)接模擬。在對(duì)接計(jì)算的初始階段生成了500 個(gè)位姿，從中選擇了100 個(gè)最佳位姿，通過1 000 步共軛梯度最小化算法來進(jìn)行最低能量?jī)?yōu)化。所有的分子對(duì)接模擬過程均使用Schr?dinger 2009軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜

紫外吸收光譜見圖2，其中曲線1 是BTPPOBSA 體系的紫外吸收光譜，曲線2 是BSA 的紫外吸收?qǐng)D譜。對(duì)比曲線1 和曲線2 可以看出：BTPPO 與BSA的結(jié)合導(dǎo)致吸光度的顯著下降，最大吸收波長(zhǎng)從198 nm 紅移至208 nm，這表明BSA 和BTPPO 之間形成了復(fù)合物［14］。

圖2 BTPPO和BSA作用的紫外光譜圖Fig. 2 UV of BTPPO-BSA and BSA

2.2 熒光光譜

BTPPO 對(duì)BSA 熒光發(fā)射光譜的影響見圖3，可以看出：當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 時(shí)，BSA 的熒光強(qiáng)度值隨著BTPPO 濃度的增加而逐漸降低，這是因?yàn)锽TPPO 可以與BSA 結(jié)合形成BTPPO-BSA 復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光淬滅［15］。另外，隨著BTPPO 濃度的增加，熒光具有藍(lán)移現(xiàn)象，這是由熒光發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境的極性降低引起的［16］。

圖3 BTPPO與BSA相互作用的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of BSA-BTPPO system

采用同步熒光光譜法在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 條件下研究了BTPPO 對(duì)BSA 構(gòu)象的影響，結(jié)果見圖4。由圖4 可見，隨著BTPPO 濃度的增加，BSA 中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基的熒光強(qiáng)度逐漸降低。同時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)沒有出現(xiàn)明顯的位移，表明BTPPO 不會(huì)對(duì)BSA 的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響［17］。

圖4 BTPPO與BSA相互作用的同步熒光光譜圖Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BSA-BTPPO(T=293 K)

2.3 結(jié)合位點(diǎn)

為了確定BSA的酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基是否都與BTPPO 發(fā)生了作用，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 和295 nm 時(shí)測(cè)量了BTPPO 存在時(shí)BSA 的熒光光譜，結(jié)果見圖5。由圖可見，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 和295 nm 時(shí)的BSA 熒光淬滅曲線沒有重疊，并且激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 時(shí)的熒光淬滅程度略微強(qiáng)于激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm 時(shí)。這表明酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基都參與了反應(yīng)，同時(shí)也表明BTPPO 主要結(jié)合在BSA的亞結(jié)構(gòu)域ⅡA(site Ⅰ)處［18］。

圖5 BTPPO對(duì)BSA的熒光淬滅曲線1～11的cBTPPO/（10-5 mol?L-1）分別為0,0.45,0.91,1.36,1.81,2.27,2.72,3.17,3.63,4.08,4.53。Fig.5 Fluorescence quenching curves of BTPPO-BSA

2.4 結(jié)合常數(shù)和淬滅機(jī)理

BTPPO 對(duì)BSA 的淬滅機(jī)理可通過修正后的Stern-Volmer方程［8］推斷

式中F0和F分別是不存在和存在淬滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度。f是淬滅劑可接近的初始熒光物質(zhì)的分?jǐn)?shù)，K是淬滅常數(shù)。f-1和(K f)-1分別是F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]做曲線的截距和斜率。計(jì)算結(jié)果見表1。

從計(jì)算結(jié)果可以看出，BTPPO 與BSA 之間存在很強(qiáng)的相互作用，并且熒光淬滅常數(shù)隨溫度的升高而降低，這表明BTPPO 對(duì)BSA 為靜態(tài)淬滅過程［8］。

2.5 結(jié)合力

BTPPO 與BSA 相互作用的結(jié)合力數(shù)據(jù)及熱力學(xué)參數(shù)可以通過公式（3）和（4）計(jì)算得到

其中T為實(shí)驗(yàn)溫度，K為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)的大小，可以推算得到藥物—蛋白質(zhì)結(jié)合過程中的結(jié)合力［19-21］。

BTPPO-BSA 體系的ΔG，ΔH和ΔS值如表1 所示。ΔG＜0 說明結(jié)合過程是自發(fā)進(jìn)行的。ΔS＞0，ΔH＜0 說明BTPPO 和BSA 之間的結(jié)合方式主要是靜電作用和疏水作用。

表1 BTPPO與BSA的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Binding constants and thermodynamic parameters for the binding of BTPPO to BSA

2.6 結(jié)合距離

供體與受體的結(jié)合距離可以通過F?rster 理論計(jì)算得到［22］。能量傳遞效率E可以通過以下公式求得

其中r是供體和受體之間的距離。R0是傳輸效能為50%時(shí)的距離，可以通過以下公式求得

其中K2是偶極子的空間取向因子，N是介質(zhì)的折射率，φ是不存在受體時(shí)供體的量子產(chǎn)率。K2、N和φ分別取2/3、1.336和0.15。供體和受體之間的重疊面積可以通過下式求得

其中F(λ)和ε(λ)分別是激發(fā)波長(zhǎng)為λ時(shí)BSA 的熒光強(qiáng)度和BTPPO 的吸光度。通過公式(5)～(7)可以分別求得J，E和R0的值，進(jìn)而求得r的值。

BTPPO 的紫外吸收?qǐng)D譜與BSA 的熒光發(fā)射圖譜積分面積（A）見圖6。由圖6 可見，BTPPO 的加入對(duì)BSA 中色氨酸殘基的熒光產(chǎn)生淬滅效應(yīng)。圖6重疊部分的積分面積為1.19×10-14cm3·L·mol-1。進(jìn)而求得R0=1.68 nm，r=2.52 nm。供體和受體之間的距離小于7 nm，說明BTPPO 與BSA 之間可以發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。

圖6 BTPPO的紫外圖譜與BSA的熒光圖譜的重疊圖Fig.6 Overlap of the fluorescence emission spectrum of BSA

2.7 金屬離子的影響

在生命體內(nèi)，金屬離子的存在可能會(huì)影響藥物與蛋白質(zhì)的相互作用［23］。通過熒光光譜法研究了金屬離子(Cu2+,Co2+,Pb2+,Ag+,Hg2+,Cd2+)對(duì)BTPPO 與BSA 相互作用的影響。通過公式(2)求得結(jié)合常數(shù)，結(jié)果見表2。

由表2 可以看出：金屬離子(Co2+,Ag+,Hg2+,Cd2+)的存在使得結(jié)合常數(shù)降低，這是由于金屬離子與BTPPO 之間的競(jìng)爭(zhēng)行為所致。離子-蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)而抑制BTPPO 與BSA 的結(jié)合［24］，并且縮短BTPPO 在血清白蛋白中的停留時(shí)間。與此相反，Pb2+存在時(shí)BTPPO-BSA的結(jié)合常數(shù)會(huì)增加，這是因?yàn)轶w系中Pb2+，BTPPO和BSA 可以共存，Pb2+與BSA 通過金屬離子橋形成Pb2+-BSA 前體，進(jìn)而與BTPPO 結(jié)合形成BTPPOPb2+-BSA復(fù)合物。

表2 金屬離子對(duì)BTPPO-BSA體系結(jié)合常數(shù)的影響Table 2 Binding constants of BTPPO-BSA system in the presence of metal ions

3 分子對(duì)接

通過分子對(duì)接模擬研究了BTPPO 與BSA 的作用方式。從圖7可以看出，BTPPO 與BSA的結(jié)合位點(diǎn)是在BSA 的亞結(jié)構(gòu)域ⅡA(siteⅠ)上。分子對(duì)接模擬的結(jié)果：結(jié)合自由能是-27.4 kJ·mol-1，說明結(jié)合過程是自發(fā)的，作用方式主要是通過疏水和極化作用。在BTPPO-BSA 體系中，BTPPO 的疏水基團(tuán)主要是與BSA 的Leu386， Ile387， Leu429，Val432，Gly433，Cys436，Thr448 和Leu452 位點(diǎn)進(jìn)行作用。極化基團(tuán)主要是與ⅠAsn390，Arg409，Ser488和Ala489位點(diǎn)進(jìn)行作用。

圖7 BTPPO-BSA的分子對(duì)接模擬Fig.7 The docking results of BTPPO-BSA system

4 結(jié) 論

本文合成了小分子BTPPO 并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。通過熒光光譜法和分子對(duì)接模擬研究了BTPPO 與BSA的相互作用，并研究了金屬離子對(duì)作用過程的影響。熒光分析結(jié)果表明BTPPO 對(duì)BSA 的淬滅是因?yàn)樾纬闪薆TPPO-BSA 復(fù)合物，結(jié)合常數(shù)為104左右。BTPPO 分子通過疏水作用和靜電作用嵌入BSA 的疏水腔，且優(yōu)先與BSA 的ⅡA 子域（siteⅠ）結(jié)合。結(jié)合距離小于7 nm，表明存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。