益智不同組織多糖含量及其生物合成途徑分析

俞振明, 趙聰慧, 張明澤, 何春梅, 司燦, 曾丹琦, 段俊

益智不同組織多糖含量及其生物合成途徑分析

俞振明, 趙聰慧, 張明澤, 何春梅, 司燦, 曾丹琦, 段俊*

(中國科學院華南植物園, 廣東省應用植物學重點實驗室, 中國科學院華南農業植物分子分析與遺傳改良重點實驗室, 廣州 510650)

為了解益智()多糖生物合成途徑關鍵酶功能，對其莖、葉、果實中的多糖含量及其單糖組成進行了研究，并采用Real-Time qPCR分析了益智多糖生物合成關鍵酶基因的表達模式。結果表明，益智多糖含量依次為果實>葉>莖，主要由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成；利用益智轉錄組數據共獲得47 690條unigenes，其中31 892條在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數據庫獲得注釋，其中208個unigenes參與益智多糖的生物合成，涉及15個酶。表達分析表明，所篩選的18個基因在莖、葉、果實中均有表達，14個基因在果實中的表達量最高，以糖基轉移酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達量最高，且其表達模式與不同組織中葡萄糖含量的變化一致。

益智；多糖；轉錄組；糖基轉移酶

益智()為姜科(Zingiberaceae)多年生草本植物，是一味藥食同源的植物，其干燥成熟果實可入藥，主產于廣東、廣西、海南等地，與檳榔()、砂仁()、巴戟天()并稱為我國“四大南藥”。中醫認為益智味辛、性溫，在《神農本草經》、《本草綱目》等經典專著中均有記載，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效[1]。長期以來，益智野生資源日趨減少，作為保健品和中成藥的主要原料不斷被采挖，還廣泛用于休閑食品(如蜜餞、涼果等)制作，優質益智種質培育是益智產業健康發展的關鍵內容。但在實際生產過程中，益智品種培育滯后，優良種質不斷退化，嚴重阻礙了益智品質的提升[2]。因此，為提升益智品質，亟需開展益智有效成分合成途徑及調控機制的研究，進而指導益智優良品種選育和科學生產。

益智營養豐富，主要含有倍半萜類和二苯基庚烷類揮發油、黃酮和多糖等活性物質[3–5]，然而有關其多糖的研究尚不多見。多糖是益智仁中的一類重要活性成分，具有抗氧化、調節人體免疫、抑制腫瘤生長等多種功效[6–8]。按照多糖中單糖的組成，可分為均一性多糖和不均一性多糖[9–10]。在多糖的結構特征、理化性質及構效關系的研究中，單糖組成分析是基礎性和關鍵性的環節。盡管不同來源的多糖結構復雜,但都是由常見的單糖重復單元組成，它們的生物合成途徑相對一致，一般包括核苷酸糖合成與轉運，以及由糖基轉移酶參與的多糖鏈的起始、延伸、聚合與終止[11–13]。作為影響益智品質的關鍵成分，目前研究主要集中在益智果實的營養成分、化學成分、藥理活性等方面[3–5,14]，而對于活性物質的生物合成途徑及其代謝關鍵酶基因的報道鮮少。因此，厘清益智多糖生物合成途徑將對益智品質生產提供理論依據，也為深入挖掘多糖生物合成途徑的關鍵基因奠定基礎。

鑒于此，本研究以益智為研究材料，基于轉錄組測序數據，從分子水平上推斷益智多糖的生物合成途徑，重點挖掘參與益智多糖生物合成途徑中的關鍵酶基因，及其在益智莖、葉和果實中的差異表達情況，為益智品質遺傳工程改良和良種選育提供理論參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

益智()采集自廣東農墾熱帶農業研究院種植基地，于2020年6月采收，分開莖、葉和果實，用液氮速凍后，置于–80℃冰箱保存備用，用于多糖生物合成途徑關鍵酶基因的組織表達分析。以上材料由廣東農墾熱帶農業研究院梁秋玲提供。

1.2 多糖含量測定

將益智的莖、葉和果實分別洗凈、晾干，105℃殺青2 h，80℃烘干。取適量樣品粉碎后過50目篩,裝入自封袋并標記信息，貯存于干燥器中。參照Yu等[15]的方法測定多糖含量，精確稱量樣品0.25 g,經石油醚80℃回流2 h脫脂后，回收石油醚，殘渣揮干溶劑加入50 mL蒸餾水，置沸水浴中提取4 h，冷卻至室溫后過濾，濾液轉移至50 mL容量瓶中,定容，即為多糖待測液。精確量取100g/mL的葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入10 mL具塞試管中，用蒸餾水補足至2 mL, 混勻后加入新鮮配制的5%重蒸苯酚溶液1 mL，渦旋振蕩混勻，緩慢加入98.04%濃硫酸5 mL，蓋上玻璃塞，渦旋振蕩混勻后，置于沸水浴中反應20 min。反應結束冷卻至室溫，測定488 nm處的吸光值, 以吸光值為橫坐標，葡萄糖含量為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線(=198.55+1.23,2=0.999 3)。精確量取0.2 mL多糖待測液，置于10 mL具塞試管中, 用蒸餾水補足至2 mL，按照繪制葡萄糖標準曲線的方法，測定488 nm處的吸光值，從標準曲線上得出待測液中葡萄糖含量，計算益智多糖含量。

1.3 單糖組成分析

益智多糖中的單糖組成采用酸水解法[16]確定。精確量取4 mL多糖待測液，加入2 mol/mL三氟乙酸6 mL，110℃連續水解8 h，60℃濃縮至干，加入2 mL甲醇，再次蒸干除去多余的三氟乙酸，加入2 mL蒸餾水溶解，過0.22m親水性濾膜，得多糖水解液。精確量取0.4 mL多糖水解液，加入0.3 mol/mL的NaOH溶液和0.5 mol/mL的PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，M70800，購自Sigma-Aldrich)甲醇溶液各0.4 mL，混勻，于70℃水浴反應100 min。反應結束冷卻至室溫，加入0.3 mol/mL的HCl溶液0.5 mL,混勻，加入2 mL三氯甲烷洗滌，5 000×室溫離心,保留上層，棄下層三氯甲烷，重復3次，過0.22m有機濾膜，備用。

精確量取10L多糖水解液，注入高效液相色譜儀，測定。色譜柱為Ultimate?XB-C18(4.6 mm× 250 mm, 5m)。流動相為乙腈(34998，購自Sigma- Aldrich)和KH2PO4緩沖液(0.1 mol/mL, pH 6.8)= 16∶84，柱溫：30℃，波長：210 nm，流速：1 mL/min。以對照品保留時間確定單糖，用峰面積歸一化法計算各單糖的含量。

1.4 轉錄組測序數據分析

下載益智轉錄組測序數據(NCBI登陸號: PRJNA 559252)，剔除轉錄組數據中含有接頭和低質量的reads，獲得clean reads。采用Trinity軟件進行益智轉錄本組裝和拼接，采用Swiss-Prot、COG、GO、KEGG、KOG、Pfam和NR數據庫進行unigenes功能注釋，并對已注釋的unigenes進行GO分類和富集分析、KEGG代謝通路富集分析。根據注釋信息，分析益智多糖生物合成途徑，挖掘多糖生物合成的關鍵酶基因。

1.5 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(0416-50,購自北京華越洋生物科技有限公司)分別提取益智莖、葉和果實的總RNA[17]，用超微量紫外可見光分光光度計(Nano DropTM2000c，Thermo Scientific公司)測定總RNA的質量和濃度。按照反轉錄酶M- MLV試劑盒(M1701，購自Promega公司)進行反轉錄合成cDNA，所得的cDNA用于多糖生物合成途徑關鍵酶基因的組織表達分析。

1.6 關鍵酶基因的表達分析

根據多糖生物合成途徑關鍵酶基因序列信息，利用Primer Premier 5.0設計熒光定量PCR引物(表1)。選擇益智延伸因子1-(elongation factor 1-alpha,)為內參基因，將莖、葉、果實cDNA的質量濃度定量為200 ng/L。熒光定量PCR儀為Roche Light Cycler 480，操作按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(北京諾禾致源生物科技有限公司)說明書進行。反應體系總體積為10L：包括SYBR Green PCR Master Mix 5L，上、下游引物各0.4L，cDNA模板1L, ddH2O 3.2L。反應程序為95℃預變性1 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環。每反應均3次生物學重復。利用2–??CT法[18]計算基因的相對表達量，顯著性分析采用SPSS軟件的新復極差法(Duncan’s新負極差法)，繪圖采用Excel軟件。

2 結果和分析

2.1 多糖含量和單糖組成

采用苯酚-硫酸法比較了益智莖、葉和果實中的多糖含量，結果表明果實>葉>莖，果實多糖含量是莖的3.21倍、葉的2.22倍，且均達顯著差異(< 0.05)(表2)。

表1 PCR引物序列

利用柱前衍生化-HPLC法檢測益智多糖中的單糖含量，結果表明，益智不同組織中多糖的組成類似，主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成，以葡萄糖為主。果實中葡萄糖含量為70.04 mg/g，占79.72%，是莖的7.72倍、葉的4.46倍，表明益智多糖是以葡萄糖為主構成的雜多糖。

2.2 轉錄組數據功能注釋

益智轉錄組數據經Trinity軟件組裝和拼接后，共獲得23.88 Gb Clean Data，包含47 690條unigenes。用BLAST軟件將unigenes序列在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG數據庫中進行比對，有31 892條unigenes獲得功能注釋，占總序列的66.87%，說明益智轉錄組測序數據相對可靠。

基于COG數據庫注釋結果，10 069條unigenes被注釋，涉及26個COG分類，其中注釋最多的5個分類為“翻譯、核糖體結構與生物起源”、“一般功能基因”、“轉錄后修飾、蛋白翻轉及伴隨蛋白”、“碳水化合物運輸及代謝”和“信號轉導機制”(表3)。

表2 益智多糖和單糖含量

同列數據后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed different letters within column indicate significant difference at 0.05 level.

表3 所有序列COG分類和統計

基于GO數據庫，將17 699個unigene注釋為生物過程、細胞組分、分子功能3類，分別有9 680、8 304和8 562個unigene。基于KEGG數據庫(表4), 12 524條序列獲得注釋，共映射到129條途徑，5個主要途徑分別為核糖體、碳素代謝、氨基酸生物合成、內質網蛋白質的加工、植物激素的信號轉導，分別有833、468、406、382和366個unigene。

2.3 多糖合成途徑相關基因鑒定

益智多糖主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等單糖組成，并以葡萄糖為主(表2)。本研究挖掘得到果糖和甘露糖代謝(ko00051)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、半乳糖代謝(ko00052)、磷酸戊糖途徑(ko00030)、戊糖、氨基糖和核苷酸糖代謝(ko00520)等5條多糖相關代謝途徑，共有897個unigenes參與，其中208個unigenes編碼18個關鍵酶(包括核苷酸糖合成酶、糖基轉移酶和多糖合成調節酶)，據此推斷益智多糖的生物合成途徑。由光合作用生成的蔗糖在蔗糖合成酶(SS)作用下催化生成果糖和第一類核苷酸糖UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖也可通過-呋喃果糖苷酶(sacA)、果糖激酶(scrK)、磷酸葡萄糖變位酶(PGM)及UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)連續催化而得。蔗糖在SS、己糖激酶(HK)、甘露糖-6-磷酸異構酶(MPI)、磷酸甘露糖變位酶(PMM)和甘露糖焦磷酸化酶(GMP)果糖激酶(scrK)的共同作用下產生第二類核苷酸糖GDP-甘露糖。UDP-葡萄糖能在UDP-葡萄糖-差向異構酶(UGE)的作用下生成第三類核苷酸糖UDP-半乳糖。UDP-葡萄糖還能在UDP-葡萄糖脫氫酶(UGDH)、UDP-芹菜糖/木糖合酶(AXS)的催化下形成第四類核苷酸糖UDP-木糖，并在UDP-阿拉伯糖差向異構酶(UAE)的催化下形成第五類核苷酸糖UDP-阿拉伯糖。這些核苷酸糖在后續糖基轉移酶的作用下，進而合成益智多糖(圖1)。

表4 KEGG分類(前20個)

2.4 關鍵酶基因的表達

為明確多糖生物合成途徑中關鍵酶基因的表達特性，以延伸因子作為內參基因，對18個關鍵酶基因在莖、葉、果實中的表達情況進行Real- time qPCR檢測，結果表明，18個基因在莖、葉、果實中均有表達, 且絕大多數基因(14/18)在果實中的表達量最高。參與葡萄糖代謝的c64270.graph_c0 (編碼蔗糖合成酶SS)、c77958.graph_c0 (編碼磷酸葡萄糖變位酶PGM)、c75380. graph_c0 (編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGP)和4個編碼糖基轉移酶的基因(c85406.graph_c0、c58247.graph_c0、c96947.graph_c0、c83168.graph_c0)均在果實中高豐度表達，并以c75380. graph_c0和c85406.graph_c0的表達量最高，這可能與益智多糖主要為葡萄糖密切相關。此外，參與甘露糖代謝的c73719.graph_c0 (編碼甘露糖-6-磷酸異構酶MPI)、c71757.graph_c0 (編碼磷酸甘露糖變位酶PMM)、c94431.graph_c0 (編碼甘露糖焦磷酸化酶GMP)也均在果實中表達量較高(表5)。這表明多糖生物合成途徑中關鍵酶基因在益智不同組織中普遍存在，為其功能研究提供依據。

3 結論和討論

益智作為藥食同源的補益品來源，有1 700多年的藥用歷史，具有減緩胃痛、腹瀉、潰瘍、多尿、延緩衰老、預防癡呆等作用[1,19–20]，已逐漸形成海南和廣東的特色道地藥用資源[21]。多糖是益智中的一類重要活性成分，益智多糖具有抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫等作用[6–8]。本研究結果表明，益智莖、葉和果實中均含有多糖，以果實中多糖含量最高，達87.89 mg/g，表明果實是多糖的主要積累部位。牛晴等[22]的研究表明，益智果仁中總糖含量高于葉，葉高于莖，與本研究結果相似。海南五指山、澄邁、屯昌、廣東雷州半島、廣西南寧和安徽毫州的益智果實中的多糖含量為80.3～86.2 mg/g[23], 表明不同來源的益智果實中多糖含量差異不大。此外，對益智葉和莖多糖進行研究不僅有利于其新資源的開發利用[24]，對促進益智產業的良性發展也具有重要意義。

圖1 推斷的益智多糖生物合成途徑。括號內的數字表示基因數量。

表5 qPCR分析益智多糖生物合成途徑中關鍵酶基因的表達

同行數據后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed different letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level.

雖然植物多糖已被廣泛發現，但仍有大部分植物多糖被證實本身不具有生物活性或只有很弱的生物活性。這是由于植物多糖結構與其生物活性緊密相關，可以通過化學修飾改變原有結構，進而增強部分多糖的生物活性[25]。多糖是一種聚合糖高分子碳水化合物，而單糖是多糖的基礎組成部分，由不同單糖通過糖苷鍵連接、縮合、失水形成多糖[12–13]。對于益智多糖結構的研究，單糖組成是最基本的研究對象。通過PMP柱前衍生-HPLC法分析表明, 益智果實中多糖由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成，以葡萄糖含量最高(表1)。趙祥升等[26]報道益智果實的多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和甘露糖組成。Shi等[10]報道益智果實多糖由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和甘露糖組成。Han等[27]報道益智果實多糖以葡萄糖為主要單糖，與本研究的結果相似。目前益智多糖的分子結構已有報道，而益智多糖的生物合成途徑卻少有研究，因此，開展益智多糖合成途徑的分析具有重要意義。

通過對益智轉錄組數據進行功能注釋，獲得了47 690條unigenes，其中31 892條在NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數據庫獲得注釋。通過基因GO分類，主要有生物過程、細胞組分和分子功能等3大功能，其中代謝過程、催化活性過程和細胞過程等3個子分類注釋的基因數量較多。基于KEGG數據庫，挖掘得到果糖和甘露糖代謝(ko00051)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、半乳糖代謝(ko00052)、磷酸戊糖途徑(ko00030)、戊糖、氨基糖和核苷酸糖代謝(ko00520)等5條多糖相關代謝途徑，共有897個unigenes參與，其中208個unigenes編碼18個關鍵酶，編碼糖基轉移酶(GT)的unigene最多，其次是蔗糖合成酶(SS)。根據挖掘得到的多糖合成途徑關鍵酶，結合其他植物中多糖生物合成途徑的相關報道[11–13,28–29]，推斷出益智多糖的生物合成途徑，這為深入開展益智品質形成機理提供了豐富的數據資源。

多糖生物合成途徑中的18個關鍵酶基因在益智莖、葉、果實中的表達存在差異，具有組織特異性，總體而言在果實中的表達量比莖、葉中高，推測多糖代謝物在果實中的合成量比其他組織中高。本研究結果表明，參與益智多糖中葡萄糖代謝的基因，如蔗糖合成酶基因、磷酸葡萄糖變位酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因和糖基轉移酶基因均在果實中的表達量最高，尤其是糖基轉移酶基因(c85406.graph_c0)與UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(c75380.graph_c0)，這與益智不同組織中葡萄糖含量變化較為一致，推測為調控益智多糖生物合成的關鍵基因。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶是植物多糖合成過程中的關鍵限速酶，負責調控多糖合成的起始步驟[30]。糖基轉移酶廣泛存在于生物界，在糖基化反應中發揮重要作用，催化活性糖基從糖基供體轉移到糖基受體，進而催化糖苷鍵的形成，最終合成糖鏈[28–29,31]。這些為今后探究UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和糖基轉移酶在益智多糖代謝途徑中的功能奠定了基礎。通過比較益智不同組織中的多糖含量, 并基于轉錄組測序數據分析益智多糖的生物合成途徑，從分子水平上揭示益智多糖生物合成途徑及其關鍵酶的分子機制，將有助于開發和利用益智資源。

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Analysis of Polysaccharide Content and Biosynthesis Pathway in Different Tissues of

YU Zhenming, ZHAO Conghui, ZHANG Mingze, HE Chunmei, SI Can, ZENG Danqi, DUAN Jun*

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

To understand the key enzyme functions of polysaccharide biosynthesis pathway in, the polysaccharides contents in stems, leaves and fruits and monosaccharide composition were studied, and the expression pattern of key enzyme genes involved in the biosynthetic pathway of polysaccharide was analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results showed that the polysaccharides contents in different tissues was in the order of fruit>leaf>stem. The polysaccharide was consist of glucose, xylose, mannose, galactose and arabinose. A total of 47 690 unigenes were obtained fromtranscriptome database, of which 31 892 were annotated in NR, Swiss-Prot, KEGG, COG, KOG, GO and Pfam databases. Among them, 208 of unigenes encoding 18 enzymes were involved in the biosynthesis ofpolysaccharide. Furthermore, all of 18 selected unigenes were expressed in stems, leaves and fruits, of which 14 unigenes showed the highest expression in fruit.Interestingly, two genes, encoding glycosyltransferase and UDP glucose pyrophosphorylase, exhibited the highest expression, and their expressions were consistent with the glucose content in different tissues of.

; Polysaccharide; Transcriptome; Glycosyltransferase

10.11926/jtsb.4374

2021-01-04

2021-03-04

廣東省重點領域研發計劃(2020B020221001); 國家自然科學基金項目(32000257)資助

This work was supported by the Project for Key Research and Development in Guangdong (Grant No. 2020B020221001), and the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32000257).

俞振明(1988～ )，男，博士，主要從事藥用植物次生代謝調控研究。E-mail: zhenming311@scbg.ac.cn

通信作者 Corresponding author. E-mail:duanj@scib.ac.cn