殼聚糖鎵配合物的制備及抗菌性能研究*

付 豪，萬 強，趙明源，戚曉宇，馬紅艷

(天津科技大學 化工與材料學院，天津 300457)

0 引 言

抗生素自問世以來，就迅速成為對抗細菌感染的首選藥物。然而幾十年來，人們對抗生素的不合理和過度使用，使得細菌的耐藥性正在以驚人的速度增長[1]。出現了許多多重耐藥細菌菌株(MDR)，其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(VRSA)、抗萬古霉素腸球菌(VRE)和多重抗藥性結核桿菌(MDR-TB)等“超級細菌”菌株已成為目前抗菌劑的主要挑戰[2]。針對這一現狀，傳統的抗生素已經不能滿足抗菌需求，研究者們將目光轉移至具有長效性、廣譜抗菌性的無機抗菌劑[3]。

目前，殼聚糖(CS)作為一種天然、安全、無毒的抗菌防腐劑，在服裝、食品和生物醫藥等領域具有廣泛的應用前景[4-6]。然而，殼聚糖本身抗菌能力較弱，因此提高CS的抗菌能力及抗菌持效性是亟待解決的關鍵問題。當前提高CS抗菌能力常用的策略之一是向CS材料中添加外源抗菌金屬添加物，如Ag、Cu、Zn、Ti以及一些金屬氧化物，以提高CS復合材料的抗菌能力[7]。金屬Ga3+由于其離子半徑，電離勢和電子親和力與Fe3+很相似，可以代替Fe3+與鐵轉運蛋白形成復合物并將其傳遞到細胞中[8]，但Ga3+并不能與Fe3+一樣參與氧化還原反應[9]，這使得鎵可以通過鐵載體進入細菌細胞來抑制細菌生長。正是鎵這種獨特的抗菌機制，使它成為潛在的有效抗菌劑，用來治療抗生素耐藥菌引起的感染[10]。

然而，單一Ga3+的抗菌活性較低，需要與載體結合來提高其抗菌活性，同時CS氨基基團上的氮原子具有的孤對電子使得殼聚糖具有極好的金屬絡合能力。綜上，為了提高殼聚糖和Ga3+的抗菌活性，本研究用CS作為載體與Ga3+結合，獲得殼聚糖鎵配合物(CS-Ga)。這種配合物結合了殼聚糖與鎵的諸多優點，殼聚糖與Ga3+發揮協同抗菌作用，顯示出優異的抗菌效果；殼聚糖又可以充當藥物緩釋載體，為鎵類化合物在抗菌方面的應用提供更廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥90%)，北京索萊寶科技有限公司；無水氯化鎵(99.999%)阿拉丁試劑(上海)有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市匯杭化工科技有限公司；鹽酸(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司。

85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇中大儀器科技有限公司)；ZF-6050型真空干燥箱(鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司)；WPL-65BE型電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；YA28X-4T/10Ⅱ型高壓蒸汽滅菌鍋(寧波永興醫療器械公司)；Varion EL CUBE元素分析儀(德國元素分析系統公司)；Thermo iCAP65型電感耦合等離子發射光譜儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖鎵復合物的制備

稱取2 g烘干后的殼聚糖粉末，溶于200 mL 0.5%的鹽酸溶液中，在60 ℃下攪拌6 h。加入6 mL 1 mol/L的氯化鎵溶液，將混合溶液在55 ℃水浴鍋中反應24 h后取出冷卻至室溫，調節pH至6.5，加入3倍體積無水乙醇，靜置過夜，將沉淀反復抽濾并用無水乙醇洗滌數次，然后置于60 ℃下真空干燥至恒重。

1.2.2 粘均分子量的測定

配制0.2 mol/L NaCl-0.1 mol/L醋酸混合溶劑。準確稱取0.05 g干燥后的CS-Ga，溶解于混合溶劑中，定容至50.0 mL。粘度測定時控制水浴槽溫度在(25±0.1)℃內，用移液管量取10.0 mL溶液至粘度計內，恒溫20 min后測量流出時間t。用稀釋法配制不同濃度梯度的殼聚糖溶液，并測量溶液流出的時間。溶液的特性粘度ηsp=ηr-1=(t-t0)/t0，式中，t為溶液流出的時間，t0為溶劑流出時間。

根據Huggins公式ηsp/C=[η]+k[η]2C可以求出聚合物的極限粘數[η]。將ηsp/C對濃度C作圖，外推至C為0處，截距即為極限粘數[η]。再根據 Mark-Houwink公式[η]=KMα可計算出粘均分子量M，對于給定的聚合物，式中K、α為常數，本實驗條件下，采用K=1.81×10-3，α=0.93[11]。

1.2.3 元素分析

使用元素分析儀和電感耦合等離子發射光譜儀進行分析，功率1 150 W，泵轉速50 r/min，輔助氣體流0.50 L/min，霧化器氣流0.55 L/min，冷空氣流12.00 L/min對樣品的各元素含量進行測定；

1.2.4 掃描電子顯微鏡分析

取少量干燥24 h后的樣品粘在導電膠上，用洗耳球吹掉導電膠表面粘固不牢的顆粒，然后對其進行噴金處理，掃描電壓20 kV，用JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡對其進行觀察。

1.2.5 紅外光譜表征

將制備好的樣品干燥24 h以后用瑪瑙研缽研磨成細粉，再取1 mg與干燥后的溴化鉀粉末研磨混合均勻，用小藥勺將粉末轉移至模具中壓制成片，采用布魯克品牌的TENSOR 27型號的紅外光譜儀器進行檢測。

1.2.6 X射線衍射分析

對制備好的樣品進行X射線衍射檢測。測試條件為：管壓40 kV，強度50 mA，掃描范圍為5～60°，掃描步長2θ為0.02°/step，掃描速度為1 s/step。

1.2.7 差示掃描量熱分析

對樣品進行差示掃描量熱測定。測試方法如下：取10 mg樣品放入鋁杯并密封，以氧化鋁為對照，在氮氣環境下，以10 ℃/min的速度從40 ℃升溫到700 ℃。

1.2.8 最低抑菌濃度檢測

將大腸桿菌(E.coli)與金黃色葡萄球菌(S.aureus)在營養瓊脂培養基平板上劃線于37 ℃下培養24 h后，分別挑取單一菌落接種至50 mL液體LB培養基中活化，再將活化后的菌液用PBS緩沖液稀釋至105CFU/mL備用。

稱取CS和CS-Ga分別加入10 mL液體LB培養基中，使得培養基中的藥品終濃度分別為0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22 mg/mL，對照為不加藥的空白培養基。將已備好的菌懸液取50 μL分別加入培養基中，每組相同的藥品濃度準備3個平行樣品。E.coli在37 ℃培養24 h，S.aureus在37 ℃培養48 h。培養結束后，取菌懸液稀釋到106CFU/mL后，分別取100 μL在平板中涂布分別于37 ℃下培養24和48 h后，統計平板上生長的菌落數，得到CS和CS-Ga的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.9 不同作用時間對CS-Ga抑菌性能的影響

準確稱取50.0 mg的CS和CS-Ga粉末分別倒入試管中，加入50 mL磷酸鹽緩沖液 (PBS)溶解，并超聲分散30 s后，對照為空白添加。溶解好的藥品須經直徑0.22 μM孔徑的濾菌器過濾才可使用。取10 mL的濾液加入按1.2.8中步驟準備的105CFU/mL的菌懸液50 μL，振蕩混勻10 s，分別靜置10、30、60 min，每組相同條件的實驗準備3個平行樣品，用移液槍分別取0.5 mL混合菌懸液加入到含有4.5 mL無菌的磷酸鹽緩沖液的試管中，重復操作，連續稀釋102、103、104、105倍后，用移液槍分別取3 μL的菌液滴在10 g/L的LB固體培養基上，倒置放在37 ℃下恒溫培養箱中靜止培養48 h后，觀察記錄結果。

2 結果與討論

2.1 粘均分子量的測定

利用烏氏粘度計測量CS和CS-Ga的粘均分子量，得到兩者的比濃度與濃度的關系如圖1所示。在同一溶劑，同一溫度下，利用Huggins方程外推計算得到的[η]可以直觀地表現二者分子量的差距。

圖1 CS和CS-Ga的ηsp/C-C關系圖Fig 1 ηsp/C-C diagram of CS and CS-Ga

由表1可以得出，CS的粘均分子量為1.23×106，CS-Ga的粘均分子量為1.712×104，這是因為在反應過程中，分子的長鏈結構被破壞變成短鏈，導致CS的特性粘度和粘均分子量都大大降低。

表1 CS和CS-Ga粘均分子量的測定結果

2.2 元素分析

分別對CS和CS-Ga進行有機元素分析及ICP元素分析，其結果見表2。數據表明，CS-Ga與CS的碳氮比相等且與理論值接近，說明殼聚糖單體結構沒有改變；樣品中鎵的含量占比達到13.30%，推測殼聚糖單體和鎵的配比約為3∶1。

表2 CS和CS-Ga中各元素的比例Table 2 The proportion of each element of CS and CS-Ga

圖2 CS(a)和CS-Ga(b)的掃描電鏡圖Fig 2 SEM of CS and CS-Ga

從圖中觀察得，CS與CS-Ga均呈分散均勻的顆粒狀物質，CS粒徑介于20～100 μm之間，顆粒呈片狀；CS-Ga的粒徑介于10～30 μm之間，與CS相比，顆粒較小，并且分布均勻。這與2.1節結果吻合，CS-Ga的顆粒較小，粘均分子量較低。

2.3 紅外光譜分析

3 480 cm-1附近是O—H伸縮振動造成的吸收峰，3 264 cm-1左右的吸收峰屬于N-H伸縮振動[12]。圖1顯示在殼聚糖鎵配合物中3 300 cm-1左右的吸收峰由3 361.18 cm-1移至3 352.28 cm-1，并且峰形變得更寬，說明鎵的加入使得N-H鍵伸縮作用減弱，N-M鍵加強[13]。殼聚糖中的1 659.02 cm-1為酰胺Ⅰ譜帶(C=O)、1 597.10 cm-1為酰胺Ⅱ譜帶(N-H)，而在殼聚糖鎵配合物中，酰胺Ⅱ譜帶消失，可能是殼聚糖的氨基發生了配位。1 423.96 cm-1是殼聚糖的CH2彎曲振動和CH3變形振動吸收峰，該峰在殼聚糖鎵配合物中變寬，吸收變弱，說明殼聚糖的分子內和分子間氫鍵形成方式發生變化。殼聚糖上的二級醇羥基的特征吸收峰也由1 077.50 cm-1移至1 075.11 cm-1，說明了殼聚糖的二級醇羥基可能也參與了配位。

圖3 CS(a)和CS-Ga(b)的FT-IR曲線Fig 3 FT-IR spectra of CS and CS-Ga

2.4 結晶性分析

殼聚糖是低結晶性高分子，在研究的2θ角度范圍內，殼聚糖的主要結晶峰在10.15°、15.3°、19.95°等處。而在CS-Ga的衍射圖中，晶體反射角出現在12°和26°，同時，峰形變得更寬更矮。以上結果說明殼聚糖在結合了鎵離子之后，晶體結構被進一步破壞，耦合效應阻礙了分子內氫鍵的形成，使分子內的單元排列從有序變為無序，結晶度降低。

圖4 CS(a)和CS-Ga(b)的X射線衍射圖Fig 4 X-ray diffraction patterns of CS and CS-Ga

2.5 熱穩定性分析

由圖5(a)的TG-DTG曲線可以看出，殼聚糖的熱分解分為兩個階段：第一個階段為25～100 ℃，樣品失重10.47%，主要原因是脫去了樣品所帶的水分；第二個階段為220～360 ℃之間，殼聚糖失重39.48%，在292.86 ℃時，殼聚糖的熱分解速率達到最大。在整個過程中，殼聚糖的總失重量為64.86%。由圖5(b)的TG-DTG曲線可以看出，殼聚糖鎵配合物的熱分解也分為兩個階段：第一個階段為25～160 ℃，殼聚糖鎵配合物失重9.27%，主要原因是脫去樣品所帶的水分；第二個階段為200～400 ℃，殼聚糖鎵配合物失重31.28%，在273.50 ℃時，殼聚糖鎵配合物的熱分解速率達到最大。在整個過程中，殼聚糖鎵配合物的總失重量為50.72%。與殼聚糖相比，殼聚糖鎵配合物由于結合了鎵離子，其分子內的氫鍵結構發生改變，結晶度降低，熱穩定性減小，這一結果與文獻報道一致[13-14]。

圖5 CS(a)和CS-Ga(b)的TG和DTG曲線Fig 5 TG-DTG curves of CS and CS-Ga

2.6 最低抑菌濃度檢測

由圖6、7可以看出，在0.1～0.22 mg/mL的濃度范圍內，三者對于E.coli與S.aureus的抗菌效果均隨著濃度的增大而增加。其中，在此濃度范圍內，氯化鎵對E.coli與S.aureus的抗菌效果均不太顯著，殼聚糖鎵金屬配合物的抗菌效果最為明顯。對于E.coli，殼聚糖鎵配合物的最低抑菌濃度為0.18 mg/mL，低于殼聚糖的最低抑菌濃度0.22 mg/mL；對于S.aureus，殼聚糖鎵配合物的最低抑菌濃度為0.16 mg/mL，低于殼聚糖的最低抑菌濃度0.18 mg/mL。以上結果表明，殼聚糖在結合了鎵離子之后，抗菌活性得到了提升，這個結果與多個文獻所報道的殼聚糖金屬配合物的抗菌性高于殼聚糖的抗菌結果一致[15-18]。

圖6 不同濃度的CS，GaCl3和CS-Ga對大腸桿菌的抑菌效果Fig 6 Antibacterial effect of different concentrations of CS, GaCl3 and CS-Ga on E. coli

圖7 不同濃度的CS，GaCl3和CS-Ga對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig 7 Antibacterial effect of different concentrations of CS, GaCl3 and CS-Ga on S. aureus

2.7 不同作用時間對CS-Ga抑菌性能的影響

由于CS-Ga對E.coli的抗菌性與殼聚糖的差異不大，所以研究了CS和CS-Ga分別與S.aureus接觸不同時間后對其活性的影響。圖8(D～F)是殼聚糖與S.aureus混合培養10、30、60 min后，在胰蛋白酶瓊脂板接種培養后的數碼照片; 圖8(G～I)是殼聚糖鎵配合物與S.aureus混合培養10、30、60 min后，在胰蛋白酶瓊脂板接種培養后的數碼照片；圖8(A～C)為空白對照。培養皿上的1、2、3、4分別代表不同的稀釋倍數下接種細菌生長情況。殼聚糖由于其分子鏈上有氨基的存在，具有一定的抑菌殺菌性能。在結合了鎵離子后，鎵離子可以進入細胞從而影響細菌的鐵代謝途徑，抑制細菌正常的代謝活動。殼聚糖與鎵離子發揮協同抗菌的作用，使得殼聚糖鎵配合物的抗菌性提高。CS-Ga與細菌作用10 min時，便發揮了作用，作用60 min后，CS-Ga便可完全抑制S.aureus的生長。圖8中菌落生長情況很直觀地顯示了CS-Ga對S.aureus具有優異的抗菌性。

注：A～C：與對照混合10、30、60 min后；D～F：與CS混合10、30、60 min后；G～I：與CS-Ga混合10、30、60 min后圖8 金黃色葡萄球菌的菌落生長狀況Fig 8 Colony growth status of S. aureus

3 結 論

成功制備了殼聚糖鎵配合物，通過粘度法、有機元素分析、ICP、SEM、FT-IR、XRD對其進行了表征，利用熱重測試了其熱穩定性，并對殼聚糖鎵配合物的抗菌性能進行體外抑菌試驗。

(1)殼聚糖與鎵的結合導致分子內氫鍵結構發生了改變，使得殼聚糖鎵配合物結晶度降低，結晶度的降低有利于配合物藥物的擴散和吸收，直接增強了其分散性和間接增強其抗菌性能。

(2)與殼聚糖相比，殼聚糖鎵配合物粒徑明顯減小，熱穩定性有所降低。在與鎵結合的過程中，殼聚糖分子中的羥基、氨基、乙酰氨基參與了配位，合成的殼聚糖鎵配合物中，鎵的含量為13.3%，同時依據鎵在此配合物中以三價形式存在，由此推測殼聚糖單體與鎵的配比約為3∶1。

(3)體外抑菌實驗表明，殼聚糖鎵配合物對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.18和0.16 mg/mL，濃度為1.0 mg/mL的殼聚糖鎵配合物在與細菌混合培養僅60 min后，即可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。