一種感染性非人靈長類實驗裝置的生物安全研究

李巧紅，鮮巧陽，王 蓓，王 勇，張振東，王 洋，周 立，湯宏斌

非人靈長類(主要是獼猴)動物模型廣泛應用于例如埃博拉等烈性病原微生物感染相關的藥物和疫苗的開發[1-2]。利用獼猴模型進行感染性科學研究，必須有與研究目的相適應的飼養環境和設施，獼猴在飼養及實驗活動過程中的動物福利要求也高于其它實驗動物，因此，猴飼養裝置的規格及內環境參數要求較高。國外生物安全實驗室內的猴飼養裝置主要采用兩種模式。第1種，采用普通式猴飼養籠具，將籠具置于高等級生物安全實驗室內。實驗人員穿戴正壓防護服進行相關實驗操作。第2種，在高等級生物安全實驗室內配備負壓隔離籠，將實驗及動物飼養過程中潛在的病原微生物暴露風險控制在隔離籠內[3]。

目前，國內對于高等級生物安全實驗室專用的非人靈長類實驗裝置沒有統一的行業標準和規格。用傳統的非人靈長類籠進行烈性病原微生物，如結核分枝桿菌、流感等氣溶膠的研究時，頻繁飼喂及進行實驗操作時無法對實驗人員進行有效的保護，存在較大的暴露風險，防護不當可能會導致感染。因此，自主研發相應的動物飼養和解剖設備，并制定相應的檢測評價標準將有助于生物安全關鍵設備的國產化和標準化。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置原理 感染性非人靈長類實驗裝置如圖1所示，隔離系統包括兩個或多個由不銹鋼外殼以及玻璃門完整密封拼接之后形成的外部殼體,殼體內設置有籠，分為上、下兩層。在殼體上部及背部設置有頂置燈罩和后置燈罩。殼體有送風通道和排風通道,送風通道位于殼體上方,送風通道依次設置有送風口、送風閥、送風風機、管道、安裝在隔離系統相鄰殼體之間的導流風扇、負壓隔離器右側的濾網及導流板；排風通道設置有右側背部排風高效過濾器、與此相連的排風管、殼體上方排風閥、排風風機、排風口,排風口經過軟管與實驗室排風設備相連接。還有安裝在殼體頂部用于切換自循環模式及補新風模式的氣動閥門。負壓隔離器左側安裝有監測過濾器的壓差表。可編程邏輯控制器(PLC)控制單元對自循環模式、補新風模式之間的切換進行控制，通過控制送、排風風量，最終達到壓力梯度的控制要求。氣流自循環系統首先通過PLC控制單元打開氣動閥門，關閉送風閥、氣流通過濾網及導流板，循環風機、管道、氣動閥門、送風風機進入殼體內，再通過導流風扇,形成平流層，起到活塞效應，到達濾網及導流板,實現氣流自循環。在此過程中，可按照需求送新風，通過PLC控制單元對送、排風進行控制,調節風量,此時關閉氣動閥門,打開送風閥，新風通過送風口、進入管道，隨后經送風風機進入殼體內,通過導流風扇,到達右側背部高效過濾器,經過排風管、打開排風閥、經排風風機,通過排風口排到實驗室排風設備。在達到送新風要求的同時，保證殼體內的負壓梯度的要求，最終達到污染空氣不會泄露到殼體外(如圖2)。除此之外，本隔離裝置有多個飼養實驗單元，每一飼養實驗單元包括外籠和內籠，內籠設在外籠包括隔離板、第一外籠門和第二外籠門，外籠通過隔離板隔離成上層和下層，上層通過第一外籠門開閉，下層通過第二外籠門開閉，內籠包括第一內籠和第二內籠，第一內籠設在隔離器上層內，第二內籠設在隔離器下層內，隔離裝置的第一內籠和第二內籠可拆卸地安裝在外籠內，第一內籠底面設有第一通道，第二內籠頂面設有與第一通道連通的第二通道，第一通道上設有可拆卸地第一通道門；在實驗中，打開外籠門時，內籠送排風系統依然形成定向氣流，既可以保證籠內動物正常通氣，也可完全阻斷籠內空氣的外溢。

圖1 感染性非人靈長類實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the Non-human primate isolation device

圖2 感染性非人靈長類實驗裝置通風原理圖Fig.2 Ventilation principle of the Non-human primate isolation device

1.2 設備參數設定及檢測 按照《Ⅱ生物安全柜YY5069-2011》中的氣流煙霧模式測試方法，使用空氣定向檢測儀(HBI-201，優禮福公司)，觀察負壓設備工作窗口氣流模式。同時使用熱敏式風速儀(AR866A，希瑪公司)檢測截面風速。圖中下籠展示為工作創口的結構圖，其中紅色圈 “O”處為檢測點位置，共10個(如圖3)。

圖3 感染性非人靈長類實驗裝置內監測點分布圖Fig.3 Detection points in the Non-human primate isolation device

1.3 指示菌和生物氣溶膠發生模型制備 大腸桿菌為環境中常見微生物，且在普通環境中生存能力較強，為排除自然環境中大腸桿菌對實驗的干擾，采用具有氯霉素抗性基因的基因工程菌作為指示微生物。在開放籠門和密閉籠門兩種狀態下，對自主研發的非人靈長類實驗裝置內微生物進行檢測[4]。氯霉素抗性的大腸桿菌E．coli的基因工程菌株為Rossetta菌，在LB培養基中進行培養時加入濃度為50 μg/mL氯霉素(Cl+)。針對該菌的計數常采用固態的LB培養基。

將含有小鼠墊料的小鼠籠盒放入正常工作的隔離器，將過夜培養的指示菌液(5×1010個氯霉素抗性的菌)與小鼠墊料充分混合，再放入兩只8周齡C57BL/6雌性小鼠(動物飼養繁殖AUP#2019078，實驗項目號S01319050R)。小鼠在小鼠籠盒內翻騰墊料時，引起指示菌飛揚，模擬氣溶膠的發生。

1.4 沉降指示菌采集 使用含有50 μg/mL氯霉素的LB固體培養基的培養皿(9 cm直徑)采集實驗裝置內和生物安全實驗室區域的沉降菌，采集時間為2 h，放在37 ℃培養箱中培養48 h，對平皿的菌落進行計數。實驗方法參照 GB/T 14925-2010[5]，采樣點見圖4：

圖4 生物安全三級實驗室內采樣點分布圖Fig.4 Sampling points in the facility and animal isolation device at the ABSL-III laboratory

1)空白對照，IV房間，兩個放置點(IV房間1#和2#取樣皿)；

2)III房間，四個方位，各一個放置點(III房間1-4#取樣皿)；

3)III房間實驗籠內籠門正下方，2個放置點(III房間5-6#取樣皿)；

4)內籠的四個方位，各一個放置點(III房間7-10#取樣皿)；

5)外籠門正下方，1個放置點(III房間11#取樣皿)。

1.5 生物氣溶膠顆粒收集 參照GB14925-2010實驗動物環境及設施空氣潔凈度檢測方法采集實驗裝置內生物氣溶膠顆粒。使用氣體撞擊采樣器(FSC-A6，宏瑞公司)進行收集。氣流速度為28.3 L/min，采樣時長15 min/次，采樣孔徑為第6級(0.65～1.1 μm)，內含50 μg/mL氯霉素的LB固體培養基的培養皿(9 cm直徑)[6]。

1.6 實驗裝置的消毒驗證 非人靈長類籠的消毒采用汽化過氧化氫發生器(HTY-SUPER SD2，泰林公司)管道消毒模式，將過氧化氫消毒機的進出氣口分別于猴籠主機的進出風口相連，汽化的過氧化氫通過進風口進入主機送風系統、猴籠和主機排風系統，然后進入過氧化氫發生器進行循環消毒(如圖5)。參數設置：濕度30%，滅菌時間30 min，除殘40 min，過氧化氫蒸汽流量4.0 L/min。于1、2號籠的4個籠位(1、2號籠位置如圖1所示)分別在遠近端放置過氧化氫化學指示條(TERRAGENE)和APEX鋼片式生物指示劑(HMV-091，含嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子)，滅菌結束后將APEX鋼片式生物指示劑放入含顏色指示劑的TSB液體培養基(MesaLabs)，56 ℃培養7 d后觀察結果，培養時設置陽性對照。判斷標準：化學指示條顏色由棕色變成黃色表示經過了過氧化氫消毒；液體培養基顏色未變色(紫色)，表示未有細菌生長，顏色變黃或渾濁，表示有菌生長。最終以化學指示條變黃且培養液未變色(紫色)判斷為消毒合格。

圖5 過氧化氫消毒方式示意圖Fig.5 Schematic diagram of hydrogen peroxide disinfection

2 結 果

2.1 實驗裝置基本參數 如圖6所示，在開門狀態下，測試飼養內籠與負壓外套之間通風截面的定向氣流流速，均能形成明顯的定向氣流。4個籠位的四周截面流入氣流平均流速為0.408 75 L/min。上下側截面風速的數值有一定的差別，但左右側截面的定向氣流數值較為均衡，如圖6所示。

圖6 籠位內籠與外套之間截面的定向氣流Fig.6 Directional airflow in the cross-section between the cage and the outer shell

2.2 指示菌檢測 按照所示位置放置含氯霉素的LB平皿采集下沉菌落(圖7)。在進行實驗之前，所有位置放置的平皿均未檢測到指示菌。 在非人靈長類籠內放置模擬氣溶膠發生模型的制備。將外籠關閉，將平皿開蓋放置指定位點，放置2 h后收集平皿，放在37 ℃培養箱中培養48 h，對平皿的菌落計數。檢測結果發現，外籠關閉狀態下，房間內、籠外及外籠均未檢測到指示菌，僅在內籠檢測到指示菌富集(7±8.25)(圖7A)。而將外籠打開進行實驗，檢測結果發現，外籠開啟狀態下，房間內、籠外及外籠同樣均未檢測到指示菌，僅在內籠檢測到指示菌富集(4±3.67)(圖7C)。且內籠氣流順風端平皿富集的指示菌數量大于逆風端(圖7B和D)。

方位1#上1#下2#上2#下上0.40.590.40.48下0.20.330.440.3左0.50.30.470.51右0.50.290.480.4

圖7 收集指示菌的數量和分布Fig.7 Number and distribution of collected indicator bacteria

2.3 生物氣溶膠檢測 在15 min內采集實驗裝置各部位0.65～1.1 μm的生物氣溶膠(圖8)，內籠各部位均有指示菌氣溶膠，其中內籠中間部位氣溶膠顆粒濃度最高(15個)。籠外房間及內籠門側門外均未收集檢測到指示菌氣溶膠顆粒。

圖8 生物氣溶膠收集及分布Fig.8 Collection and distribution of bioaerosols

2.4 動物實驗裝置消毒驗證 將模擬氣溶膠發生模型移出，對實驗裝置內部進行過氧化氫蒸汽循環消毒。結果如圖9所示，圖9A為過氧化氫化學消毒指示條結果(最右側試紙條為未經過氧化氫消毒的陽性對照紙質條，未變色為棕色)；圖9B為APEX鋼片式的生物指示劑消毒后的菌片培養結果(9號為未經過氧化氫消毒的陽性對照試管，變為黃色)。圖中1-8號指示條和菌片分別對應的位置分別為：1、2是1#上籠位的遠、近端；3、4是1#下籠位的遠、近端；5、6是2#上籠位的遠近端；7、8是2#下籠位的遠近端。放置于1#和2#四個籠位中近端和遠端共8個位置上的化學指示條的顏色由棕色變為黃色，表示指示條所處的位置經過了過氧化氫的消毒；APEX鋼片式生物指示劑培養液沒有變色(紫色)，表示指示劑上的嗜熱芽孢桿菌已被滅活。

圖9A為過氧化氫化學消毒指示條結果；圖9B為APEX鋼片式的生物指示劑消毒后的菌片培養結果圖9 實驗裝置消毒效果檢測Fig.9 Detection of the effects of disinfection on the experimental device

3 討 論

感染性動物實驗裝置其主要的功能要求有3方面：一是根據實驗所需的動物生活習性，滿足所飼養的動物在生存方面的需求。二是能根據實驗供試品的生物安全等級和要求，在設計使用時確保生物安全。三是使用具有靈活性，其在設計使用時應當便于進行實驗操作。在滿足各項動物福利的同時，也不能出現任何生物安全方面的問題[7]。傳統飼養籠具規格龐大且安裝起來十分復雜，很難根據動物的生活習性進行調整。目前國內也并沒有針對高等級生物安全實驗室內猴隔離器的原位消毒標準，很難對猴籠進行全方位的消毒。近年來，特別是新冠肺炎疫情以來，從事病原微生物的研究人員不斷增加，這就使得針對相關的病原微生物的生物安全問題，逐步成為人們備受關注的熱點問題[8-12]。

大腸桿菌常被用作追蹤環境、水和食品污染源的指示劑[13-15]。經過簡單處理，溶液中的大腸桿菌即可形成氣溶膠大腸桿菌氣溶膠能作為指示劑，研究雞舍周圍的生物氣溶膠來源及其向環境空氣的傳播方式，也被用于負壓屏障設施動物飼養籠具暴露風險的測試和評估。因此，本文借助于大腸桿菌氣溶膠，評估猴隔離器的阻止氣溶膠感染的效果。

通過定向氣流的檢測和制造指示菌氣溶膠發生模型的方法，經落下菌自然沉降收集和氣體撞擊采樣器主動收集后培養，均證明無論其外籠在打開還是在關閉狀態下，內籠內產生的細菌/氣溶膠均未在籠外檢測出，使病原微生物被隔離在籠內。可見，該裝置能有效防止氣溶膠污染的風險，能將病原微生物暴露風險控制在隔離籠內，這有助于為一些病原體自然感染的研究提供新的設備平臺。

在消毒方面，采用循環過氧化氫蒸汽消毒的方法能夠有效地進行原位消毒。這大大提高了實驗裝置的消毒效率和裝置循環使用的生物安全可靠性。此種針對非人靈長類實驗裝置的原位消毒方法將會為國內該類型裝置的消毒提供參考依據。

相較于傳統非人靈長類籠裝置，該實驗裝置的實施能夠制定相關設備的技術標準，建立可靠的現場評價方法，提供安全可靠的操作規程。且在設計上采取了內籠和外籠設計、上下層布局，飼養籠可以進行組合和拼裝。這種設計能夠根據生物安全實驗室核心區的使用面積自由組合隔離器的數量。還能根據獼猴群居的特性，在隔離器之間設計動物通道，使非人靈長類籠之間貫通。這種理念首次出現在生物安全實驗室內非人靈長類飼養隔離器的設計中，能夠大大增加實驗動物福利，同時也為一些病原體自然感染的研究提供了新的設備平臺。

利益沖突：無

引用本文格式：李巧紅，鮮巧陽，王蓓，等.一種感染性非人靈長類實驗裝置的生物安全研究[J]．中國人獸共患病學報，2021，37(11)：965-970. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.144