津島鏈霉菌JT-2F對三七根腐病菌的抑制作用

宋利沙 蔣妮 張占江 陳乾平 馮世鑫

摘要：【目的】明確津島鏈霉菌JT-2F對三七根腐病菌的抑制作用，為三七根腐病的生物防治提供理論依據?！痉椒ā坎捎闷桨遛卓购蜑V紙條法測定津島鏈霉菌（Streptomyces tsukiyonensis）菌株JT-2F對三七根腐病菌和3種三七葉部病害病原菌的的抑制作用，并采用離體塊根刺傷接種法測定菌株JT-2F對三七根腐病菌的防治效果;利用酶聯免疫分析（ELISA）法測定菌株JT-2F發(fā)酵液中蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶等酶活性?！窘Y果】菌株JT-2F對三七根腐病菌具有較強的拮抗作用，其抑菌率達76.47%，對3種三七葉部病害病原菌也有明顯的抑制效果，抑菌率均超過80.00%。菌株JT-2F的發(fā)酵液對病原菌菌絲有明顯的抑制作用，使菌絲體畸形、膨大變粗，并呈串珠形狀。產酶能力測定結果顯示，菌株JT-2F可分泌幾丁質酶、蛋白酶和纖維素酶，可破壞病原菌菌絲體，并抑制病原菌生長。離體防效試驗結果顯示，菌株JT-2F發(fā)酵原液對離體三七塊根根腐病的防效達78.43%?！窘Y論】津島鏈霉菌菌株JT-2F對三七根腐病菌有較好的抑制作用，具有較好的生防開發(fā)潛力。

關鍵詞： 三七;根腐病菌;津島鏈霉菌;抑制作用

中圖分類號： S435.672 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2133-07

Inhibitory of antagonistic Streptomyces tsukiyonensis JT-2F to Fusarium solani of Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen

SONG Li-sha1， JIANG Ni1*， ZHANG Zhan-jiang1*， CHEN Qian-ping1， FENG Shi-xin1

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning ?530023， China）

Abstract：【Objective】The inhibitory effect of Streptomyces tsukiyonensis JT-2F against Fusarium solani of Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen was clarified to provide theoretical basis for biological control of root rot of P. notoginseng. 【Method】The inhibition effect of S. tsukiyonensis JT-2F on F. solani and three P. notoginseng leaf disease pathogens was determined by plate antagonism and filter paper method， and the control effect of JT-2F strain on P. notoginseng root rot was determined by in vitro root tuft injury inoculation method， ?enzyme-linked immunoassay （ELISA） was used to determine the activities of protease， cellulase and chitinase in fermentation broth. 【Result】The results showed that JT-2F had a strong antagonistic effect on F. solani， and its inhibition rate reached 76.47%. The control effect of strain JT-2F on three JT-2F strains fermentation broth had obvious inhibitory effect on the pathogenic mycelium， which made the mycelium deformed， enlarged and thickened， and in a string ofbeads shape.JT-2F strain could secrete protease， cellulase and chitinase to destroy the mycelia and inhibit the growth of the pathogen. In vitro control effect test showed that JT-2F fermentation broth showed 78.43% control effect of in vitro P. notoginseng root rot. 【Conclusion】S. tsukiyonensis JT-2F strain can inhibit the growth of F. solani of P. notoginseng， and has potential in bio-control development.

Key words： Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen;Fusarium solani; Streptomyces tsukiyonensis;inhibiting effect

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation Joint Funding Cultivation Project（2019GXNSFAA245040）; The Fund for Local Science and Technology Development Guided by the Chinese Government（Guike ZY20198010）; Youth Science Fundation of Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants（Guiyaoji 201801）; Guangxi Botanical Garden Science and Technology Innovation Team Project （2019007）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng （Burk.） F.H. Chen]為五加科人參屬多年生植物，是我國特有的大品種中藥材，主要分布于廣西和云南等地，具有散瘀止血、消腫定痛、降血脂等功效（國家藥典委員會，2020）。目前，根腐病是三七種植面臨的重要問題，主要集中在由鐮孢屬真菌（Fusarium spp.）引起的根腐病（董鮮等，2018;張晉豪等，2020），其發(fā)病原因復雜，防治難度較大。當前三七根腐病的防治以化學藥劑為主，但長期使用化學農藥易使病菌產生抗、耐藥性（丁中等，2001;張明亮等，2019），使防治效果下降，甚至對環(huán)境造成污染，產生的農藥殘留也嚴重影響中藥材的質量安全，危害人類健康。相比于化學防治技術，微生物防治植物病害因具有高效、安全、環(huán)保的優(yōu)點，已逐漸成為植物病害防治的重要方法之一，是目前國內外研究重點，也是未來有機中藥材生態(tài)種植的發(fā)展趨勢?！厩叭搜芯窟M展】放線菌由于能產生大量結構多樣的具有抗菌活性的抗生素，且存在于不同類型的土壤和水中，菌種資源更豐富，因而在生物防治的應用中更為廣泛和有效（Lee and Hwang，2002;Jung et al.，2018）。目前，放線菌用于防治作物病害的研究已有較多報道。宗兆鋒等（2002）研究發(fā)現，從番茄葉片上分離獲得的放線菌對7種病原真菌（大麗輪枝菌、擴展青霉菌、膠孢炭疽病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉紅聚端孢菌和梨狀毛霉菌）具有不同程度的抑制效果;董美玉等（2008）研究表明，從土壤中分離到的放線菌ZY105對黃瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率達85%;申哲等（2008）和涂璇等（2008）研究發(fā)現，淡紫灰鏈霉菌對番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黃瓜炭疽病菌等多種植物病原菌均有很好的拮抗作用;劉琴等（2020）研究表明，使用婁徹氏鏈霉菌SR-1102的100倍液灌根對番茄枯萎病的防治效果達72. 84%;牛紅杰等（2020）從黃瓜根際土壤分離得到1株小鏈霉菌，該菌對黃瓜枯萎病菌（尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和立枯絲核菌）具有一定的抑制作用;湯曼利（2020）研究表明，海洋放線菌梅久蘭鏈霉菌F28對海洋細菌副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌均具有較強的抑制作用，并對其他8種病原菌具有廣譜抑菌活性。放線菌對中藥材根腐病抑制作用的研究有少量報道，強薇等（2014）研究發(fā)現，從人參根際土壤中篩選出的7株放線菌對人參根腐病的拮抗率達65.11%;杜用璽等（2020）研究表明，3株放線菌及其發(fā)酵液對丹參根腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超過60%?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期研究發(fā)現1株放線菌津島鏈霉菌（Streptomyces tsukiyonensis）JT-2F對三七根腐病菌具有很強的拮抗作用（Song et al.，2020），但尚未就該菌對三七根腐病菌的抑制作用開展研究?！緮M解決的關鍵問題】采用平板拮抗和濾紙條法測定菌株JT-2F對三七根腐病菌和3種三七葉部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F發(fā)酵液對三七根腐病菌的抑制作用，評價其對三七根腐病菌的抑制效果;在光學顯微鏡下觀察菌株JT-2F對三七根腐病菌抑制作用的影響;利用酶聯免疫分析（ELISA）法測定菌株JT-2F發(fā)酵液中蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶活性，以驗證菌株JT-2F對三七根腐病菌的抑制作用;進一步開展離體塊根防效研究，從表觀上證明津島鏈霉菌菌株JT-2F對三七根腐病的防治作用，為三七根腐病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 供試三七葉部病害病原菌包括三七灰霉病菌（Botrytis cinerea）、三七黑斑病菌（Alternaria panax）和三七炭疽病菌（Colltetorrichum gloeosporioides），根部病害病原菌為三七根腐病菌（F. solani），均由廣西藥用植物園植物病理研究室保存提供。供試津島鏈霉菌JT-2F為廣西藥用植物園植物病理研究室保存鑒定的菌株，菌株登錄號MK368447。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 采用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌。參考仇艷肖（2010）的方法，分別制備含幾丁質、羧甲基纖維素鈉和酪蛋白的培養(yǎng)基，以檢測菌株是否具有幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶的活性。幾丁質培養(yǎng)基：膠體幾丁質5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO4 0.3 g，K2HPO4 0.7 g，ZnSO4 0.001 g，瓊脂20.0 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。羧甲基纖維素鈉（CMC）培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2SO4 0.5 g，K2HPO4 0.25 g，瓊脂20.0 g，H2O 1000 mL。酪蛋白培養(yǎng)基：取5.0 g脫脂奶粉加入到50 mL蒸餾水中，另稱1.5 g瓊脂溶于50 mL蒸餾水，將2種溶液分開滅菌，待冷至45～50 ℃時，將2種溶液混勻倒平板，即成牛奶平板。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株JT-2F對三七根腐病菌及其葉部病害病原菌的抑制作用測定 采用平板對峙法測定菌株JT-2F對三七根腐病菌及其葉部病害病原菌的抑菌效果，采用濾紙條法復篩（張瑾等，2014）。平板對峙法：將直徑為0.5 cm的病原菌組織塊置入PDA培養(yǎng)基中心，在其兩側等距離處接種菌株JT-2F組織塊，以只接種病原菌為對照，每處理3個重復;待對照長滿整個平皿時，測量菌落直徑，計算抑制率。抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。濾紙條法：對菌株JT-2F進行發(fā)酵，取直徑為5 mm的3個菌餅接種于裝有高氏一號液體培養(yǎng)基（100 mL）的三角瓶（250 mL）中，于28 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，制備種子液，然后按10%的接種量接種于裝有100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)7 d后，于10000 r/min離心15 min，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，制得上清液為無菌發(fā)酵液;在PDA培養(yǎng)基中心接種三七根腐病菌菌餅，在菌餅兩側等距離放置經發(fā)酵液浸沒過的無菌濾紙條，以無菌水作對照，3次重復;抑制率計算參照平板對峙法。

1. 2. 2 菌株JT-2F發(fā)酵液對致病菌的拮抗作用測定

發(fā)酵液的制備方法參考1.2.1濾紙條法。采用含毒介質法測定發(fā)酵液對病原菌的抑制作用。取適當比例發(fā)酵液與50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻，倒平板，用于拮抗病原菌試驗。用鑷子挑取三七根腐病菌和處理菌株菌落的菌絲，制玻片。在光學顯微鏡下分別觀察處理菌株和對照菌株菌絲體的形態(tài)特征，并拍照統(tǒng)計。

1. 2. 3 菌株JT-2F產酶能力測定 參照仇艷肖（2010）、劉洋等（2016）的方法進行菌株JT-2F產酶能力初篩。挑取菌株JT-2F菌塊分別置于幾丁質、羧甲基纖維素鈉和酪蛋白培養(yǎng)基上，觀察有無透明圈產生，若產生透明圈，則表明有幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶產生;采用酶聯免疫分析法測定產酶菌株制得的發(fā)酵液中各種酶活性（宋利沙等，2019）;用酶標儀在450 nm波長處測定不同酶活的吸光度（OD），通過標準曲線計算樣品中待測指標的濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度或酶活。

1. 2. 4 菌株JT-2F對三七根腐病菌的離體防效試驗

采用刺傷接種法（方中達，1998）測定菌株JT-2F對離體三七塊根根腐病菌的防效。選取大小一致的3年生三七塊根，先用自來水沖洗干凈，75%酒精表面消毒后無菌水沖洗、晾干，置于超凈工作臺用無菌接種針在塊根上刺1個直徑為6 mm的圓形接種面，將拮抗菌株的發(fā)酵濾液原液和稀釋液（分別稀釋10、20、50、100和200倍）分別涂抹在傷口處，然后在傷口處接種三七根腐病菌菌餅（直徑7 mm），對照涂抹無菌水，每處理3次重復，5 d后測量并記錄病斑面積，計算防效。病斑面積和防效計算公式參考薛應鈺等（2020）。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS 22.0計算平均值和標準差，并進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 菌株JT-2F對三七根腐病菌的拮抗作用

從圖1和圖2可看出，菌株JT-2F對三七根腐病菌有明顯的抑制作用，抑菌率達76.47%（表1）。菌株JT-2F對三七葉部病害病原菌也有明顯的抑制效果，抑菌率均超過80.00%，其中對三七黑斑病菌的抑制率達87.06%，顯著高于對其他三七病害病原菌的抑菌率（P<0.05，下同）（表1），表明菌株JT-2F具有廣譜抑菌性。

2. 2 菌株JT-2F發(fā)酵液對三七根腐病菌菌絲的抑制作用

在光學顯微鏡下，觀察到受菌株JT-2F影響的三七根腐病菌菌絲生長畸形，菌絲膨大變粗，呈串珠形狀，而正常菌絲光滑、細直（圖3），表明菌株JT-2F發(fā)酵液對病原菌菌絲的抑制作用明顯。

2. 3 菌株JT-2F產酶能力測定結果

菌株JT-2F的產酶能力測定結果見圖4。圖4-A～圖4-C均有明顯的水解圈，表明菌株JT-2F分別能產生和分解培養(yǎng)基成分的3種酶，包括幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶;取該菌株的無菌發(fā)酵液測定3種酶的活性，結果顯示，幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶的活性分別為177.49、89.01和444.92 U/L。說明菌株JT-2F能產生纖維素酶、幾丁質酶和蛋白酶等水解酶。

2. 4 菌株JT-2F對三七根腐病菌的離體防效測定結果

菌株JT-2F對三七根腐病菌的離體防效測定結果（表2和圖5）表明，隨著發(fā)酵液稀釋倍數的增加防效相應降低，其中，發(fā)酵原液的防效最高，達78.43%，顯著高于其他液稀釋倍數處理，當發(fā)酵液稀釋至50倍時防效降至55.10%，稀釋至100和200倍時防效分別下降至30.83%和26.29%，防治效果不理想。

3 討論

鏈霉菌能產生多種抗生素，廣泛應用于農業(yè)、工業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)，在植物病害生物防治方面也發(fā)揮著重要作用（薛應鈺等，2020）。本課題組前期從腫節(jié)風健康植株的根際土壤中分離得到1株鏈霉菌，經形態(tài)學和分子生物學鑒定為津島鏈霉菌（Song et al.，2020），該菌對三七根腐病菌及其他三七葉部病害病原菌均具有較好的抑制作用。申哲等（2008）、涂璇等（2008）、顏霞等（2020）研究表明，淡紫灰鏈霉菌（S. lavendulae）gCLA4對番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、小麥紋枯病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌、蘋果樹腐爛病菌及獼猴桃潰瘍病菌等多種植物病原菌均有很好的拮抗作用，具有較好的生防開發(fā)價值;胡夢君等（2020）研究發(fā)現，放線菌菌株1331的10%和20%發(fā)酵稀釋液對南方根結線蟲2齡幼蟲48 h的校正死亡率分別達88.97%和100.00%，可有效抑殺南方根結線蟲，具有潛在生防價值;雷艷娟等（2020）從13種荒漠植物中分離出533株內生放線菌，其中有74株鏈霉菌對尖孢鐮刀菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等6種靶標菌具有較好的抗菌活性;錢瑤等（2020）研究發(fā)現，鏈霉菌IMS002的發(fā)酵液及其產生的化合物Borrelidin對尖孢鐮刀菌具有良好的抑菌效果和抑制活性;孫洪寶等（2020）研究發(fā)現，生防鏈霉菌A02對西瓜枯萎病的防治效果達68.23%，且接種鏈霉菌A02可增加西瓜幼苗株高、莖粗、鮮重和干重。本研究結果表明，津島鏈霉菌菌株JT-2F對藥用植物三七根腐病具有良好的抑制作用和離體防效，但菌株JT-2F對三七根腐病菌的抗病分子機制、對其他種類三七根腐病病原菌抑菌效果，以及是否能促進植物生長發(fā)育等還需進一步探究。

放線菌能產生豐富的次生代謝產物，常能通過液體發(fā)酵產生拮抗活性物質來誘導對植物病害的抗性。本研究中菌株JT-2F液體發(fā)酵原液使三七根腐病菌菌絲生長畸形，菌絲膨大變粗，呈串珠形狀，表明產生了抗生類物質。此外，菌株JT-2F產酶能力測定結果顯示均有透明的水解圈，表明菌株JT-2F能分泌幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶等水解酶。據文獻報道，菌株產生水解酶可破壞致病真菌的細胞壁，使其菌絲體結構溶解死亡，從而達到防病的作用（仇艷肖，2010）。杜用璽等（2020）研究發(fā)現，生防鏈霉菌屬zyzx-001菌株及其發(fā)酵液均可對丹參根腐病病原菌產生較強的抑制作用;郭景紅等（2020）研究表明，玫瑰黃鏈霉菌（Strempomyces roseoflavus）的代謝產物對多種重要的植物病原菌均具有較強的抑制作用，從發(fā)酵液提取誘抗粗蛋白，發(fā)現其可誘導黃瓜葉片中活性氧（ROS）的積累和多種氧化酶（過氧化物酶、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶）等抗病相關酶活性的顯著提高，通過實時熒光定量PCR測定，發(fā)現誘抗粗蛋白還可誘導黃瓜葉片中PR-1a、PR-3、PR-9和NPR1等抗病相關基因上調表達;甄丹妹等（2020）研究發(fā)現，玫瑰黃鏈霉菌菌株活性代謝產物可誘導黃瓜產生抗病性的信號轉導。本研究進行了菌株JT-2F發(fā)酵液對三七根腐病離體防效試驗及其產生細胞壁水解酶的初步研究，后續(xù)尚需在盆栽和田間等復雜環(huán)境中驗證鏈霉菌的生防效果，有關菌株JT-2F對病原真菌細胞壁破壞和菌絲體溶解機制等也有待深入研究。

4 結論

津島鏈霉菌菌株JT-2F對三七根腐病菌有較好的抑制作用，發(fā)酵原液對離體三七塊根根腐病具有良好的防治效果，并能產生多種抗菌活性物質，具有較好的生防開發(fā)潛力。

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（責任編輯 麻小燕）

收稿日期：2020-12-28

基金項目：廣西自然科學基金聯合資助培育項目（2019GXNSFAA245040）;中央引導地方科技發(fā)展專項（桂科ZY20198010）;廣西藥用植物園青年基金項目（桂藥基201801）;廣西藥用植物園科技創(chuàng)新團隊項目（2019007）

通訊作者：蔣妮（1979-），https：//orcid.org/0000-0001-8319-4338，副研究員，主要從事中藥材病蟲害防治研究工作，E-mail：jiangni292@126.com;張占江（1976-），https：//orcid.org/0000-0002-0497-529X，博士，副研究員，主要從事藥用植物高質量栽培繁育工作，E-mail： zzj1811@163.com

第一作者：宋利沙（1987-），https：//orcid.org/0000-0002-4502-0879，博士，主要從事中藥材病蟲害防治研究工作，E-mail：lishasong@126.com