基于聚類分析和主成分分析的洋槐蜜成熟過程中主要成分變化研究

吳美佳，佘 僧，黎洪霞，尹 欣，周金慧,2，陳蘭珍,2,

（1.中國農業科學院蜜蜂研究所, 北京 100093；2.農業農村部蜂產品質量安全控制重點實驗室, 北京 100093）

蜂蜜作為一種天然食品，經蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或分泌物，在蜂巢中經濃縮、揮發等加工釀制而成。蜂蜜中富含多種營養成分，如糖類、蛋白質、礦物質、酶以及其它微量物質維生素、有機酸、酚類物質和芳香物質等[1-2]。蜂蜜中的低聚糖和多酚具有很高的生物活性功能及醫藥價值。低聚糖可不經腸胃消化而直接被人體吸收，以減少腸胃負擔，此外還具有調節血糖、抗菌等功效[3]，酚類化合物在預防和治療胃腸道疾病、水腫、癌癥、代謝問題、心血管疾病及炎癥等方面有很好的應用[4-6]。蜂蜜品質的好壞主要受蜜源植物、地理氣候、蜂種、后期加工儲存以及蜂蜜是否成熟等多種因素的影響[7]，其中蜂蜜的成熟過程決定了真實蜂蜜全部的營養物質成分[8]。我國傳統養蜂方式大多采取“追花逐蜜”，為在花期內增大產量和減少成本以達到高利潤的目的，會采取提前搖蜜、縮短取蜜周期的方式[9]。這種生產模式下的蜂蜜并未成熟，含水量較多，需要人工進行濃縮處理，會造成蜂蜜營養物質的損失。造成這種情況的原因除了我國特殊的養蜂模式外，還有蜂蜜的自然成熟過程研究不足，且缺乏完善的成熟蜜判定標準。洋槐蜜來源于木本植物洋槐（Robinia pseudoacaciaL.）的花蜜，不易結晶、味道香甜醇厚、略有清香味[10]，是一種深受消費者喜愛的單花種蜂蜜。我國北方地區是洋槐蜜的主產區，主要分布于遼寧、河北、山西、山東、陜西和甘肅等地。受地域、氣候等環境因素的影響，各地的洋槐開花時間略有差異，一般集中在四月至六月。相對油菜、荊條等蜜源植物而言，洋槐的花期及流蜜期較短，一般維持在15 d和7 d左右。為增大洋槐蜜產量，在洋槐花期及流蜜期內會采取提前搖蜜的方式，使得洋槐蜜成熟度不足。

已有相關文獻對蜂蜜在成熟過程中營養物質的變化進行報道，遲韻陽[11]測定了油菜和洋槐蜜的花蜜、蜜囊蜜、水蜜和成熟蜜的糖含量，發現蜂蜜成熟過程中主要發生的變化為蔗糖水解為果糖和葡萄糖，且隨著蜜蜂的不斷加工，蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖等糖的總含量呈現上升趨勢。馬天琛[12]研究表明，成熟和非成熟洋槐蜜的理化指標存在顯著差異（P＜0.05），非成熟洋槐蜜經濃縮后總酚酸和總黃酮含量明顯下降。Gismondi等[13]通過對比洋槐蜜和洋槐花蜜，發現洋槐蜜成熟以后其糖及簡單酚類等物質含量增加，水分含量顯著降低，此外，研究還發現成熟洋槐蜜的體外抗氧化、真核細胞抗氧化及抑菌實驗效果都優于洋槐花蜜。然而，目前尚未發現對蜂蜜成熟過程中低聚糖及多酚類物質含量變化的相關研究。

我國目前缺乏成熟蜜的判定依據，本研究通過測定洋槐蜜成熟過程中水分、單糖及二糖、9種低聚糖及18種多酚含量，揭示其營養物質和生物活性的變化規律，挖掘成熟洋槐蜜的特征指標，旨在為成熟洋槐蜜的采收提供合理意見，并為成熟蜂蜜標準制定提供數據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗選取山西省晉城市沁水縣（海拔1010 m，N: 35°52′40，E: 112°15′48）作為采樣點，為保證蜜源充足和排除其他干擾因素，試驗時間選擇洋槐花期的5月中旬，從同一蜂場選取意蜂蜂群無病害且群勢相同的三個蜂箱，并提前對其巢脾做清空處理；分別從三個蜂箱內采集第3、5、8和11 d蜂蜜樣本，每個蜂箱采集3個樣本，共收集36個樣本。乙腈、吡啶、β-苯基葡萄糖苷、HMDS+TMS+吡啶、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和9種低聚糖標準品（麥芽酮糖、松二糖、帕拉金糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖、蔗果三糖、吡喃基葡蔗糖、松三糖） 北京百靈威科技有限公司；18種多酚標準品：沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、苯甲酸、楊梅酮、桑色素、槲皮素、柚皮苷、芹菜素、山奈酚、柯因、松屬素、咖啡酸苯乙酯、高良姜素 美國Sigma-Aldrich公司；所有試劑未明確標注純度的均屬于分析純。

阿貝折光儀 上海精密科學儀器有限公司；PL203電子天平（精確度：0.0001） 美國梅特勒-托利多儀器有限公司；Milli-Q型純水器 美國Millipore公司；CR22GⅡ冷凍離心機 日本Himac公司；TTLDC氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司；恒溫干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；2695-高效液相色譜儀、6460-高效液相色譜串聯質譜儀 美國安捷倫科技有限公司；QP2010-PIUS氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 36個洋槐蜜樣品均先室溫放置2 h后，攪拌使樣品混合均勻。

1.2.2 水分、單糖及二糖含量測定 水分測定方法參考AOAC Official Method 969.38[14]和Heinz-Dieter等[15]的方法，使用阿貝折光儀在25 ℃條件下進行測定。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的測定方法參考《GB 5009.8-2016 食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》[16]。具體步驟為：準確稱取2.0 g蜂蜜樣本（精確至0.0001 g）至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻，4℃下8000 r/min離心5 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾后裝入1.5 mL進樣瓶，利用HPLC進行測定。

1.2.3 低聚糖含量測定 9種低聚糖的檢測方法參照She等[17]的方法。具體步驟為：稱取0.5 g洋槐蜜樣本于50 mL離心管中，向其中加入25 mL 80%乙醇溶液，旋渦充分溶解，于4 ℃下10000 r/min離心10 min后，取上清液 100 μL，50 ℃ 下氮氣吹干，加入20 μLβ-苯基葡萄糖苷（0.25 mg/mL，溶于吡啶），加入200 μL 2%鹽酸羥氨溶液，于70 ℃下反應30 min，然后加入衍生劑HMDS+TMS+吡啶300 μL，于70 ℃下反應 40 min，在 4 ℃下 10000 r/min離心 5 min，取上清液，利用GC-MS進行測定。

1.2.4 多酚含量測定 18種多酚類物質的檢測方法參考Tanleque-Alberto等[18]和Dittgen等[19]的方法。具體步驟為：稱取洋槐蜜樣本5.0 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL鹽酸水溶液（pH=2），旋渦充分溶解，于4 ℃下10000 r/min離心10 min，取上清液待固相萃取。Oasis HLB固相萃取柱依次用10 mL甲醇和10 mL鹽酸水溶液（pH=2）活化，然后將蜂蜜樣本上清液倒入活化后的Oasis HLB固相萃取柱，再用10 mL超純水清洗萃取柱，隨后用10 mL甲醇洗脫酚類物質。洗脫液在40 ℃氮氣吹干后，用1 mL 0.1%甲酸：乙腈（90:10, v/v）溶液溶解。將復溶液用0.22 μm尼龍膜過濾后裝入1.5 mL進樣瓶，利用HPLC-MS/MS進行測定。

1.3 數據處理

采用Excel 2016進行數據整理，用SPSS19.0 統計分析軟件（IBM，美國）對數據進行方差分析和顯著性檢驗（采用LSD法進行多重比較，不同小寫字母表示在P＜0.05水平下差異顯著），柱狀圖和折線圖采用 Origin 8.5（Origin Lab，美國）繪制，熱點圖和聚類圖通過上傳數據到在線程序中繪制完成，網址如下：https://software.broadinstitute.org/morpheus/。主成分分析利用SIMCA 14.1軟件（Umetrics，瑞典）完成。每個樣本做三次平行實驗，同一蜂箱內三個樣本做平均值處理，聚類分析和主成分分析前，對數據進行標準化處理。

2 結果與分析

2.1 洋槐蜜成熟過程中水分、單糖及二糖含量變化規律

表1為洋槐蜜成熟過程中水分、單糖及二糖含量變化圖，結果表明，水分含量在洋槐蜜成熟過程中不斷降低，且在不同成熟天數下含量差異顯著（P＜0.05）。在第11 d封蓋時水分含量為16.33 g/100 g，整個成熟過程中水分含量下降了5.77 g/100 g。此外，果糖在洋槐蜜不同成熟天數下無顯著性差異（P＞0.05），含量保持穩定。而葡萄糖含量在不同成熟天數下差異顯著（P＜0.05），呈現先升高后降低的趨勢。蔗糖和麥芽糖未檢出。

表1 洋槐蜜成熟過程中主要成分含量（g/100 g）Table 1 Main components contents of acacia honey during the ripening process (g/100 g)

水分含量是評定蜂蜜質量標準的重要參數指標。蜂蜜成熟過程中水分含量下降，主要是由于蜂巢中內勤蜂不斷煽動翅膀加速水分蒸發，并將蜜液涂到巢房壁上以增大水分蒸發面積[20]。而葡萄糖含量在洋槐蜜成熟后期含量下降，可能是被蜂蜜中的葡萄糖氧化酶氧化成過氧化氫和葡萄糖酸所致[21]。

2.2 洋槐蜜成熟過程中低聚糖含量變化規律

低聚糖在洋槐蜜成熟過程中含量變化趨勢（見圖1）可以歸納為以下幾個方面：麥芽酮糖（0.54～1.39 g/100 g）、松二糖（1.78～3.43 g/100 g）、吡喃基葡蔗糖（0.20～2.63 g/100 g）、異麥芽糖（0.13～0.38 g/100 g）的含量大致呈現上升趨勢，且成熟后期與成熟初期含量差異顯著（P＜0.05）；帕拉金糖（0.16～1.23 g/100 g）的含量先升高后降低；三糖的含量逐漸降低，其中蔗果三糖（0.17 g/100 g降至 0.08 g/100 g）、松三糖（3.53 g/100 g降至0.06 g/100 g）表現的較為明顯，成熟后期其含量顯著低于初期含量（P＜0.05）；麥芽三糖（0.06 g/100 g 左右）和潘糖（0.06 g/100 g左右）的含量在洋槐蜜成熟過程中無明顯變化，含量都較低。

圖1 洋槐蜜成熟過程中低聚糖含量變化Fig.1 Changes of oligosaccharides contents of acacia honey during the ripening process

對于上述低聚糖含量的變化趨勢，上級營養物中部分三糖或多糖的分解過程非常緩慢，可能是由于花蜜中各糖類化合物相應的分解酶少，因此蔗果三糖、松三糖在洋槐蜜成熟初期含量較高。此后，松三糖的含量在洋槐蜜成熟過程中不斷降低，可能是被α-葡萄糖苷酶轉化所致，α-葡萄糖苷酶由蜜蜂分泌產生，且隨著蜜蜂不斷吞吐蜂蜜，酶含量相應增加，松三糖被轉化為葡萄糖和果糖[22]，故松三糖的含量持續降低，其含量在洋槐蜜不同成熟天數下差異顯著，故松三糖可以作為判定洋槐蜜成熟的潛在特征指標。而部分糖類物質如吡喃基葡蔗糖、異麥芽糖在初始天數中的含量不高，這可能是因蜜源植物洋槐花蜜腺體中這些糖類化合物的含量很低所致。此外，麥芽三糖和潘糖的含量在洋槐蜜成熟過程中一直處于較低水平，故不建議二者作為蜂蜜成熟度判定的指標。

2.3 洋槐蜜成熟過程中多酚含量變化規律

圖2A、B、C、D為洋槐蜜中多酚在不同成熟天數下的含量變化圖。18種多酚類物質的含量變化大致可分為以下幾種趨勢：從整體上看，蘆丁、山奈酚、原兒茶酸、對羥基苯甲酸的含量在洋槐蜜成熟過程中呈現上升趨勢，其中山奈酚、對羥基苯甲酸含量在不同成熟天數下均明顯上升，而蘆丁、原兒茶酸在采蜜期3 d之前含量較低，3 d之后含量顯著上升（P＜0.05），在 5～11 d差異不顯著；此外，沒食子酸、桑色素、阿魏酸、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸、柯因的含量呈現先升高后降低的趨勢，其中沒食子酸、阿魏酸和柯因在采蜜期5～8 d含量較高，咖啡酸、桑色素在5 d時含量最高，而高良姜素、咖啡酸苯乙酯在8 d時含量最高；而苯甲酸、對香豆酸含量呈現先降低后升高趨勢；柚皮苷含量呈現波動式變化；而楊梅酮、槲皮素、芹菜素、松鼠素在洋槐蜜成熟過程中含量大致趨于平穩，無顯著變化。

圖2 洋槐蜜成熟過程中多酚含量變化Fig.2 Changes of polyphenol contents of acacia honey during the ripening process

本文所述18種多酚類物質曾被廣泛應用于真實性溯源和營養學等研究[23-27]。本研究發現，上述多酚的含量在洋槐蜜整個成熟過程中存在差異。其中對羥基苯甲酸的含量在洋槐蜜成熟過程中一直占據總酚含量（18種多酚含量總和）的50%左右，且隨著蜂蜜成熟度的提升，含量不斷升高。對羥基苯甲酸和咖啡酸含量在洋槐蜜不同成熟天數下均變化顯著，建議可以作為評價洋槐蜜是否成熟的指標。此外，黃酮醇類化合物的含量在整個過程一直低于其他類別的化合物。黃酮醇類物質中除蘆丁、山奈酚含量不斷升高外，桑色素、高良姜素含量都呈現先升高后降低的趨勢，而楊梅酮和槲皮素的含量在蜂蜜成熟過程中趨于穩定。據文獻報道，花蜜中存在黃酮類物質，洋槐花蜜的黃酮類化合物是鼠李糖苷，它們不被蜂蜜和蜜蜂唾液中存在的酶水解[28-29]，這可能是山奈酚等幾種物質在洋槐蜜成熟過程中含量沒有減少的原因。而桑色素和高良姜素在蜂蜜成熟后期過程中含量有下降趨勢，可能是由于蜂蜜中存在的過氧化氫導致這幾種黃酮醇類化合物降解[23]。與此同時，沒食子酸、山奈酚、對香豆酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸和柯因六種多酚類物質在洋槐蜜成熟3和11 d時相較5～8 d時含量變化明顯，這可能意味著蜂蜜成熟初期和后期是多酚變化最明顯的時期。而楊梅酮、槲皮素、芹菜素和松鼠素含量在不同成熟天數下差異不明顯，在洋槐蜜成熟過程中其含量一直保持穩定，故不建議作為判定洋槐蜜是否成熟的指標。

2.4 聚類分析

層次聚類分析（HCA）可以顯示數據基于不同度量的自然分組[30]，熱點圖和聚類圖能分別顯示數據的活動和聚集狀態，實現數據的視覺互補化。以標準化后的9種低聚糖和18種多酚數據為變量，對不同成熟天數下的洋槐蜜進行聚類分析，聚類距離采用歐式距離，聚類方法采用單鏈連接法，熱點圖及樹狀圖如圖3所示。當距離為7時，成熟天數為3、5、8和11 d的洋槐蜜被很好地劃分為4類。

圖3 洋槐蜜成熟過程中低聚糖及多酚含量熱點-樹狀圖Fig.3 Heat map and dendrogram of oligosaccharide and polyphenol contents of acacia honey during the ripening process

2.5 主成分分析

主成分分析是一種數據降維技術，它將大量原有的相關變量替換為少量不相關的主成分（即派生變量），同時盡可能多地保留原始數據集中存在的內部變量信息[31]。對不同成熟天數下的洋槐蜜中9種低聚糖和18種多酚進行主成分分析，提取出特征值大于1的3個主成分。其中第一主成分特征值為4.35，貢獻率為40.39%，第二主成分特征值為2.92，貢獻率為20.95%，第三主成分特征值為1.5，貢獻率為15.0%，三個主成分累計貢獻率達到76.34%，可以解釋原始數據的大部分信息。前三個主成分得分圖及載荷圖如圖4所示，圖4A顯示不同成熟天數下的洋槐蜜分布在不同的區域，且無重疊，說明低聚糖結合多酚可以很好地實現不同成熟度洋槐蜜的區分。圖4B顯示了第一主成分主要與山奈酚、蘆丁、麥芽三糖、異麥芽糖、麥芽酮糖、松二糖、原兒茶酚、咖啡酸、對羥基苯甲酸、蔗果三糖、苯甲酸、松三糖相關性較強，第二主成分主要與沒食子酸、柯因、咖啡酸苯乙酯、松鼠素、高良姜素、帕拉金糖、對香豆酸、松二糖、麥芽酮糖、異麥芽糖、潘糖相關性較強。第三主成分主要與楊梅酮、帕拉金糖、柚皮苷、對羥基苯甲酸、阿魏酸、松三糖、槲皮素、松鼠素、高良姜素、柯因相關性較強。

圖4 洋槐蜜主成分分析三維得分圖（A）及載荷圖（B）Fig.4 3-dimensional score plot (A) and loading plot (B) of PCA of acacia honey

3 結論

本文通過測定洋槐蜜成熟過程中的水分、單糖及二糖、9種低聚糖以及常見的18種多酚類化合物含量，并結合分層聚類及主成分分析兩種化學計量學方法進行分析。結果表明：洋槐蜜在成熟過程中，水分含量不斷下降，低聚糖中部分三糖，如蔗果三糖、松三糖的含量不斷降低，少數三糖如吡喃基葡蔗糖含量升高，而麥芽三糖和潘糖的含量保持穩定，一直處于較低水平。多數二糖如麥芽酮糖、松二糖、異麥芽糖的含量不斷上升，帕拉金糖的含量則屬于先升高后降低。其次，多酚中大部分物質含量呈現一定的規則性變化。多酚類物質中蘆丁、山奈酚、原兒茶酸、對羥基苯甲酸的含量總體升高，沒食子酸、桑色素、阿魏酸、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸、柯因的含量呈現先升高后降低的趨勢，苯甲酸、對香豆酸含量呈現先降低后升高趨勢。而松三糖、對羥基苯甲酸和咖啡酸含量在洋槐蜜不同成熟天數下分別呈現顯著降低、顯著升高和顯著升高趨勢（P＜0.05），建議可以將這三種物質作為評價洋槐蜜是否成熟的指標。此外，聚類分析和主成分分析結果都表明：低聚糖和多酚可以很好地實現對不同成熟天數下洋槐蜜的區分。綜上可知，低聚糖和多酚結合化學計量學對研究洋槐蜜成熟過程具有一定的參考價值。