響應面法優化辣木籽降糖肽的酶法制備工藝及其體外活性評價

魏光強，趙 娜，范堯珠，王雪峰，黃艾祥，田 洋

（云南農業大學食品科學技術學院, 云南昆明 650201）

辣木（Moringa oleifera）是多年生熱帶落葉喬木，目前廣泛種植于我國的云南、廣東、廣西、福建、臺灣等地區，資源量豐富[1]。辣木的葉子、種子、根和花皆可食用，辣木籽富含蛋白質（質量分數29.4%～38.3%）[2]，其中 Val、Leu、Ile、His等多種氨基酸的含量接近或遠高于聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織標準模式譜，可作為優質蛋白質資源加以開發利用[3-5]。

糖尿病患者近年來呈上升趨勢，糖尿病已成為繼癌癥和心血管疾病之后威脅人類健康的第三大殺手[6]。降血糖肽一般是指可用于治療II型糖尿病的一類活性肽[7]。相較于其他天然產物類降糖功能因子，降糖肽結構清楚，作用機制明確；活性更高、用藥劑量更小、毒副作用更低[8]；與蛋白質相比，幾乎沒有免疫原性，而且可以通過化學方法合成；具有較穩定的胃腸消化特性。目前開發出的植物源降糖肽包括苦瓜降糖肽[9]、發酵大豆降糖肽[10]、靈芝降糖肽[11]、黑豆降糖肽[12]等。酶法提取降糖肽具有提取率高、反應條件溫和的特點，更適合將來的工業化生產[13]，如王晟等[14]利用木瓜蛋白酶水解山杏仁蛋白制備降血糖粗肽。辣木籽富含蛋白質，經酶解處理后能產生具有多種生物學功能的活性肽，包括抗氧化肽、抗菌肽等[15-16]。然而，有關辣木籽降糖肽的研究卻鮮有報道。

本實驗采用酶法制備辣木籽蛋白水解物，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標，通過單因素篩選和響應面優化辣木籽降糖肽的最佳酶解工藝，采用超濾法截留不同分子量范圍的酶解物并進行降糖活性分析，并通過細胞實驗研究其對HepG2細胞的抑制作用，以期為辣木籽降糖肽以及功能性食品的開發提供理論與方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木籽產自云南省德宏州，云南天佑科技開發有限公司提供；MTT、木瓜蛋白酶（80萬U/g）北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸（TCA）天津市風船化學試劑科技有限公司；PNPG（分析純）上海寶曼生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（200 U/mL）騰達生物試劑耗材有限公司；DMEM培養基美國GIBCO公司。

AD300L-H高速均質分散機上海軒澄儀器有限公司；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機上海比朗儀器制造有限公司；Merck Millipore（膜片直徑76 mm）超濾杯上海軒儀儀器設備有效公司；UV-1800CP紫外分光光度計上海美譜達儀器有限公司；Multiskan Go酶聯免疫檢測儀賽默飛世爾科技公司；HFsafe-1200LC生物安全柜上海力申科學儀器有限公司；BPN-80CW二氧化碳培養箱上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木籽蛋白的制備 參照王雪峰等[16]方法略作修改制備辣木籽蛋白。采用鹽提法將脫脂辣木籽粉用0.3 mol/L NaCl溶解，料液比1:10（w/v）。待完全溶解后用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.15，然后置于30 ℃水浴中攪拌30 min。溶解液抽濾去渣，收集濾液（抽濾液用75%乙醇清洗）。下層濾液于室溫下經4000 r/min離心30 min，收集上清液，然后再次抽濾去渣，收集下層濾液，于旋轉蒸發儀中45 ℃旋蒸45 min，最后收集濃縮液真空冷凍干燥制得凍干粉，置于-80 ℃冰箱保存，備用。測得辣木籽水溶性蛋白的純度為50.96%。

1.2.2 辣木籽降糖肽的酶法制備 稱取1 g辣木籽蛋白凍干粉，按液料比為40:1加入純水，勻漿5 min（3000 r/min），加入木瓜蛋白酶 0.55 g，于 55 ℃ 條件下酶解4.5 h，酶解結束后于95 ℃，10 min滅酶，冷卻，離心沉淀（4000 r/min，30 min），收集上清液得到辣木籽多肽酶解液，采用鄰苯二甲醛（OPA）法測定蛋白水解度。

1.2.3 酶解工藝優化

1.2.3.1 單因素實驗 以酶解溫度為55 ℃，酶解時間為 4.5 h，酶添加量為 5.5%，液料比 40:1，酶解pH7為基本條件，在其他條件不變的前提下，設置酶的添加量為2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%；液料比為 10:1、20:1、30:1、40:1、50:1；酶解時間為 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 h；酶解溫度為25、35、45、55、65 ℃；pH為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以酶解產物的蛋白水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率作為衡量指標進行單因素實驗。

1.2.3.2 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上，采用中心組合設計對酶解工藝進行優化。選取A酶解時間（h）、B料液比、C初始pH 3個關鍵影響因素進行響應面分析，因素水平編碼表見表1。

表1 響應面分析因素及水平表Table 1 Factors and level of response surface analysis

1.2.4 蛋白質水解度測定 采用鄰苯二甲醛（OPA）法[17]測定蛋白質水解度。在避光條件下向裝有3 mL OPA試劑（200 mg SDS，7.62 g四硼酸鈉，160 mg OPA，4 mL乙醇和176 mg DTT用去離子水溶解，定容至200 mL，避光保存）的試管中分別加入400 μL濃度為0.5 mg/mL的絲氨酸標準溶液、去離子水（空白溶液）和辣木籽蛋白酶解液（樣品溶液），混勻5 s后，室溫反應2 min，于340 nm處測定吸光度。蛋白質水解度按如下公式計算：

式中：DH為蛋白質水解度，%；h為被水解的肽鍵數，meqv/g；htot為蛋白質總肽鍵數，8.2 meqv/g。

OPA法測定蛋白質水解度的計算公式為：

1.2.5α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 參照Lim等[18]的方法略作修改，測定辣木籽酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制率。吸取5 μL的25 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，10 μL 的樣品溶液和 620 μL pH6.8 的 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液于試管中，混勻后于37.5 ℃下反應20 min，然后加入 10 μL 10 mmol/L PNPG 溶液，混合并在37.5 ℃下反應30 min，最后，通過添加650 μL濃度為0.2 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應。使用分光光度計測定每個樣品在405 nm處的最大吸光度，每個樣品重復測定6次。α-葡萄糖苷酶抑制率的計算公式如下：

式中：A樣品為實驗組，多肽+酶+PNPG+Na2CO3；A樣品對照為樣品對照組，多肽+PBS+PBS+Na2CO3；A對照為樣品對照組，PBS+酶+PNPG+Na2CO3。

1.2.6 辣木籽降糖肽的超濾分離 在最佳酶解工藝條件下酶解辣木籽制備辣木籽酶解液，過10、5、3 kDa三種不同截留分子量的超濾膜進行超濾粗分離，得到分子量為10、10～5、5～3、＜3 kDa 4 個組分的辣木籽酶解液，冷凍干燥制得凍干粉，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值測定 將辣木籽酶解液各超濾組分凍干粉配制成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的樣品（濃度梯度≥5），分別測定其α-葡萄糖苷酶抑制率，以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，進行非線性擬合，得出回歸方程，并計算α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值。

1.2.8 辣木籽降糖肽組分對人肝癌細胞的抑制作用參考姚興梅等[19]的方法略作修改進行辣木籽降糖肽組分對人肝癌細胞的抑制作用測定。將對數生長期的HepG2細胞傾去培養液，用3 mLPBS清洗一次，再用1 mL胰蛋白酶-EDTA消化3 min，使細胞變為球形，加入3 mL 10%牛血清DMEM培養液終止消化反應。1500 r/min離心3 min，去除上清液，調整細胞液密度約為4×104cells/mL（臺盼藍染色后計數），200 μL/孔接于 96孔板中。待 12 h細胞貼壁后，棄去原培養液，分別加入100 μL濃度為200、300、400 μg/mL的含降糖肽DEME培養基處理24、48、72 h，每個濃度設置3個復孔。以不加降糖肽的組作為空白組，只加DMSO溶液的作為試劑對照組。培養 24、48、72 h之后加入 20 μL 5 mg/mL的 MTT溶液，于培養箱培養4 h后棄盡孔內液體，最后加入150 μL的DMSO溶液。酶標儀490 nm（震板10 min）進行檢測。細胞存活率按以下公式計算：

1.3 數據處理與分析

本次試驗中α-葡萄糖苷酶抑制率數據均重復6次，結果表示均以實驗數據的平均值±標準偏差的形式呈現。采用Box-Behnken 8.0.6、SPSS 19.0進行數據處理；采用Origin 2018進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 酶解單因素實驗

2.1.1 酶添加量對辣木籽蛋白酶解產物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 酶用量作為酶解反應的基本條件，對蛋白水解活性具有重要的影響。酶添加量對酶解產物水解度及抑制率的影響如圖1。當酶的添加量較低時，酶與底物作用小，蛋白質不能被完全水解；而當酶添加量過高時，底物完全被反應后則會達到飽和，即使繼續添加酶，水解度變化不大。從圖1中可以看出隨著酶添加量的增加，水解度先急劇上升后平緩上升，主要原因是底物添加量固定不變，當酶的添加量到達一定量時，水解度不再上升，趨于平緩。而從最初2.5%的添加量開始，α-葡萄糖苷酶的抑制率一直呈現上升的趨勢，當酶添加量為5.5%時抑制率到達了最高點，酶添加量高于5.5%時α-葡萄糖苷酶抑制率緩慢下降，原因可能是一定的酶添加量有利于α-葡萄糖苷酶抑制肽的生成，而過高的加酶量會使水解產生的多肽繼續水解，將已經水解得到的降糖肽水解成為降糖活性低或者沒有活性的肽片段，從而導致酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制率降低[20]。綜合考慮，酶的最佳添加量為5.5%。

圖1 酶添加量對酶解產物水解度及抑制率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis and inhibition rate of enzymatic hydrolysis products

2.1.2 液料比對辣木籽蛋白酶解產物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 液料比對酶解產物α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度的影響如圖2。根據圖2可以看出，當液料比為40:1時，抑制活性和水解度已達到了最高點，當該比例大于40:1時，α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度呈下降的趨勢。這可能是因為植物蛋白中含有植物蛋白酶抑制劑，能與蛋白酶作用與底物共享蛋白酶的結合基團，表現出競爭性抑制作用[21]，表明最佳料液比應為40:1。

圖2 料液比對酶解產物抑制活性及水解度的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on inhibition activity and degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysis products

2.1.3 酶解時間對酶解產物抑制活性及水解度的影響 酶解時間是酶解反應的一個重要因素，如若時間太短，反應不充分，酶解效果不理想；而時間太長，酶易失活，水解效果不佳，所以合適的酶解時間對整個反應過程起著關鍵的作用。酶解時間對酶解產物活性及水解度的影響如圖3。從圖3中可以看出，酶解液的蛋白水解度隨著酶解時間的延長逐漸提升，α-葡萄糖苷酶抑制活性在4.5 h達到峰值，抑制率在4.5 h后下降，原因是在4.5 h的酶水解之后，活性肽鏈被過度酶降解，結構被破壞，并且酶產物的抑制活性大大降低[22]。所以綜合考慮，酶水解時間應控制在4.5 h。

圖3 酶解時間對酶解產物活性及水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the activity and degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysis products

2.1.4 溫度對酶水解產物的活性和水解度的影響溫度對水解效果有著顯著的影響，當酶解溫度過高時會導致蛋白構象發生改變或破壞，影響酶的活性和酶解反應的進行[23]。溫度對酶水解產物α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度的影響見圖4，由圖4可知，隨著溫度的升高，α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度的值都不斷的上升，當溫度到達55 ℃時，α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度均達到最高值，而當溫度高于55 ℃后，則出現了下降的現象，因為每種酶都有最佳的反應溫度，當溫度超過了它原本所能承受的溫度時，酶的活性反而會受到抑制而降低，影響了酶促水解的速率。因此，最佳酶水解溫度應選擇在約55 ℃。王晟等[14]研究發現木瓜蛋白酶制備山杏源降糖肽的最佳酶解溫度為50 ℃，與本研究相近。

圖4 溫度對酶水解產物的活性和水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and degree of hydrolysis of enzyme hydrolysates

2.1.5 pH對酶水解產物活性和水解度的影響 pH會影響蛋白質和蛋白酶的結構空間，使蛋白質發生變化和蛋白酶失去活性，從而對水解產生影響[24]。pH對酶水解產物的活性和水解度的影響見圖5，從圖5中可以看出，當pH為8時，酶水解產物對α-葡糖苷酶的抑制活性和水解度是最好的；而當pH小于8或者大于8時，α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度會受到酸堿條件的影響，不論是偏酸還是偏堿都會影響酶的活性和底物結構。綜合評定，最佳反應pH應為8。

圖5 pH對酶水解產物活性和水解度的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and degree of hydrolysis ofenzyme hydrolysate

2.2 響應面法優化酶解工藝研究

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據單因素實驗的結果，采用Box-Behnken Design中心組合設計原理，以酶解溫度、液料比、酶解pH為考察因素，α-葡萄糖苷酶抑制率（Y）為響應值，建立數學模型，以獲得其最佳酶解工藝條件。

Box-Behnken Design設計方案及響應值結果和Box-Behnken Design實驗方差分析如表2、表3所示。二次方程模型為：

表2 響應面試驗結果Table 2 Experimental results of response surface test

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

Y=-331.11875+28.85875A+4.70937B+46.56125C-0.15225AB-0.75000AC-0.077750BC-1.78250A2-0.041500B2-2.41750C2

根據表3所示可知該模型P＜0.01，說明木瓜蛋白酶酶解辣木籽蛋白制備降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率的回歸方程模型極顯著，同時失擬差P=0.9485＞0.05并不顯著，通過觀察失擬差的顯著性更加說明了該模型具有合理性。因此，可以使用該模型來分析和預測整體實驗結果。由表4中A、B、C的F值大小可以推斷出，3個因素對酶水解產物抑制活性的影響順序為C＞B＞A，其中C和B的影響對于酶解pH和酶水解產物更為重要。酶解pH和液料比對酶解產物速率抑制活性具有更大的作用；所有平方項影響均極顯著（P＜0.01），B2和 C2的作用更為重要；并且相互作用影響相對平方項較小，其中AB極顯著（P＜0.01），AC、BC 顯著（P＜0.05）。三個因素之間兩兩交互作用下的三維圖和等高線圖如圖6～圖11所示。

圖11 液料比與酶解pH交互作用的等高線圖Fig.11 Contour plot of interaction between material-liquid ratio and enzymatic hydrolysis pH

表4 驗證實驗結果Table 4 Verification experiment results

圖6 酶解時間與液料比交互作用的三維圖Fig.6 Three-dimensional diagram of the interaction between enzymatic hydrolysis time and material-liquid ratio

圖7 酶解時間與料液比交互作用的等高線圖Fig.7 Contour plot of the interaction between enzymolysis time and material-liquid ratio

圖8 酶解時間與酶解pH交互作用的三維圖Fig.8 Three-dimensional diagram of the interaction between enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH

圖9 酶解時間與酶解pH交互作用的等高線圖Fig.9 Contour diagram of interaction between enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH

圖10 料液比與酶解pH交互作用的三維圖Fig.10 Three-dimensional diagram of the interaction between material-liquid ratio and enzymatic hydrolysis pH

2.3 最優工藝條件確定和驗證

使用Design-Expert 8.0.6軟件分析回歸方程，確定最優工藝條件分別為酶解時間4.63 h，液料比40.51:1和初始pH為8.26。在此工藝下酶解產物的抑制活性預測值為23.6%。考慮到實驗條件和其他問題的可行性，改良的酶解工藝條件如下：酶解時間4.6 h，液料比40.5:1，pH為8.3，在此條件下，重復三組實驗，得到的辣木子蛋白酶解液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性為23.62%±0.14%，接近預測值25.38%，蛋白質的水解度為16.44%±0.02%，且三組實驗穩定性較好。

2.4 辣木籽酶解液超濾分離組分降糖活性

圖12為辣木籽降糖肽各超濾組分對α-葡萄糖苷酶的抑制率的IC50值，各超濾組分均表現出一定的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，其中分子量＜3 kDa的辣木籽降糖肽對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，其抑制率IC50值為5.56 mg/mL，說明辣木籽降糖肽截留分子量越小，抑制活性越高，與文獻報道的其他功能性多肽制備的結果[21-22,25]相似。劉麗君[26]研究表明分子量＜3 kDa的駝血酶解物超濾組分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，與本研究結果一致。

圖12 不同截留分子量的辣木籽降糖肽對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.12 Inhibitory activity of Moringa seed glycopeptides with different molecular weight on α-glucosidase

2.5 辣木籽降糖肽組分對人肝癌細胞的抑制作用

分子量＜3 kDa的辣木籽降糖肽組分對人肝癌細胞的抑制作用如圖13所示。當辣木籽降糖肽質量濃度為300 μg/mL時，作用于 HepG2細胞48 h后顯著抑制了HepG2細胞的增殖（P＜0.05），細胞存活率均低于90%，且隨著時間的延長抑制效果愈加明顯；當質量濃度為400 μg/mL，作用時間為72 h時，抑制HepG2細胞的增殖愈加顯著（P＜0.01），此時細胞的存活率為86.4%。張晶等[27]、王立峰等[28]研究表明了菜籽抗氧化肽及膜分離各組分在質量濃度為400 mg/L時也可顯著抑制HepG2細胞的增殖，而這些植物蛋白源活性肽可能會通過影響DNA的復制和有絲分裂、線粒體膜電位和鈣離子濃度的平衡狀態進而抑制細胞增殖[29]。綜上所述，＜3 kDa的辣木籽降糖肽組分對人肝癌細胞具有一定的抑制作用，但具體的抑制機理有待進一步研究。

圖13 分子量＜3 kDa的辣木籽多肽對人肝癌細胞的抑制作用Fig.13 Inhibitory effect of Moringa oleifera seed peptides with molecular weight ＜3 kDa on human liver cancer cells

3 結論

本實驗采用單因素實驗及響應面分析法優化了辣木籽降糖肽的酶解制備工藝，獲得其最佳酶解條件為酶解時間4.6 h、液料比40.5:1、pH為8.3、酶添加量5.5%、溫度為55 ℃，該條件下酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率為23.62%±0.14%，水解度為16.44%±0.02%。利用超濾法對酶解液進行組分分離，其中分子量＜3 kDa的超濾組分降糖活性最好，當其質量濃度為300 μg/mL時，能顯著抑制HepG2細胞的增殖（P＜0.05）。因此，從辣木籽蛋白中水解得到的小肽可作為用于控制糖尿病的保健食品中潛在的活性成分，研究可為后續辣木籽降糖肽的分離鑒定奠定基礎，為辣木籽功能性食品的開發提供重要參考。