鐵皮石斛花總黃酮的綠色提取工藝優化

邵 寧，刁洪林，王 薛，賀增洋，姜余婷，韓 偉，王國凱，鄒 鵬,

（1.安徽中煙工業有限公司技術中心, 安徽合肥 230088；2.安徽中醫藥大學藥學院, 安徽合肥 230012）

鐵皮石斛（Dendrobium officinal），為蘭科石斛屬草本植物，因其表皮為鐵綠色得名。其主要分布在中國西南部，如安徽、浙江、福建等地，喜陰涼濕潤，好高山巖石[1]。鐵皮石斛含有多糖、石斛堿、黃酮類、菲類、微量元素、氨基酸等多種成分，所以具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤活性等功效，被列入《中華人民共和國藥典》[2-3]。傳統鐵皮石斛制品主要以莖為原料加工而成，其鮮花和干花未能得到充分利用而造成極大浪費[4]。研究表明鐵皮石斛的莖、葉、花的成分相似，僅在含量上有所區別[5]，所以鐵皮石斛的花、葉同樣具有藥用功效。研究顯示鐵皮石斛花中多糖、生物堿、氨基酸含量相對較低，但黃酮類和酚類物質含量高于莖和葉，而該類物質具有天然的抗氧化、抗衰老作用[6]。

黃酮類成分的傳統提取方法主要使用有機溶劑，此方法存在提取效率低、環境污染嚴重等缺點[7]。Abbott等[8]于2003年所報道的DESs是一種新型綠色溶劑，有著類似離子液體的性質，具有良好的生物兼容性、安全環保等優點，被廣泛用于多糖類[9]、生物堿[10]、酚酸類[11]等生物活性成分的提取。DESs是由一定化學計量比的季銨鹽、季膦鹽等氫鍵受體（Hydrogen bond acceptor, HBA）和醇、酰胺等氫鍵供體（Hydrogen bond donors, HBD），通過分子間氫鍵作用組合而成的低熔點混合物[12]。其中以氯化膽堿為HBD的DESs制備簡單、性質穩定，應用較為廣泛[13]。目前，已有許多研究關注DESs用于提取天然植物如桂花[14]、甘草[15]、臘菊[16]中的多種化合物。而將DESs和響應面法結合用于鐵皮石斛花黃酮的研究還十分有限。因此，研究出一種綠色高效的方法來提取鐵皮石斛花中的黃酮類物質是十分必要的。

為研究鐵皮石斛花黃酮的綠色提取工藝，本研究采用篩選組分后的DESs作為提取介質，在單因素實驗的基礎上，結合BBD設計的響應面法，建立模型指導提取工藝，優化得到總黃酮的最佳工藝條件，實現高效提取；另外使用大孔樹脂吸附法回收黃酮和DESs，重復利用溶劑以評價該方法的綠色可持續性，實現鐵皮石斛花的綠色提取。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛干花（霍山） 由皖西學院提供，經鑒定為蘭科植物鐵皮石斛的花；氯化膽堿（98%）、乙二醇（99%）、1，2-丙二醇（99%）、丙三醇（99%）、尿素（AR）、乳酸（99 %）、氫氧化鈉（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、蘆丁標準品（98%）、無水乙醇（AR）、二甲基硅油 H201-100（AR） 國藥集團化學試劑有限公司；大孔吸附樹脂NAK-9、D101、AB-8鄭州新和成材料科技有限公司。

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司；80-2電動離心機 常州普天儀器制造有限公司；AL204-IC電子天平 梅特勒托利多國際有限公司；PPS2511-CE平行合成儀 日本東京理化公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DESs溶劑制備 本文采取氯化膽堿為HBA、乙二醇、1，2-丙二醇、丙三醇、尿素、乳酸等作為HBD制作DESs。將HBA、HBD置于圓底燒瓶中，在80 ℃油浴中加熱攪拌，直至形成均一透明的液體[17]。改變 HBA 和 HBD 的摩爾比（1:2、1:3、1:4、1:5），考察不同組成的DESs溶劑對總黃酮得率的影響。

1.2.2 鐵皮石斛花總黃酮的提取 將鐵皮石斛干花在40 ℃下烘干2 h至恒定質量，粉碎過80目篩備用。準確稱量干花粉末0.8 g置于試驗管中，加入DESs浸泡混合均勻后放入平行反應器，根據設計的溫度、時間進行提取實驗，之后冷卻至室溫，加入對應組成的DESs溶劑補足質量至與提取前相同，將提取液轉移至離心管，3000 r/min下離心30 min，取上清液過0.45 μm有機濾膜得到黃酮提取液[18]。

1.2.3 單因素實驗 采用得率最高的DESs作為溶劑，考察不同提取條件對總黃酮得率的影響。實驗設計四個因素，包括DESs含水量X1（0%、20%、40%、60%、80%；50 ℃，20:1 mL/g，30 min），提取溫度X2（40、50、60、70、80、90、100 ℃；20%，20:1 mL/g，30 min），液固比 X3（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL/g；20%，90 ℃，30 min），提取時間 X4（10、20、30、40、50 min；20%，90 ℃，20:1 mL/g）。對 4 個因素選擇各自最佳水平進行后續響應面優化實驗。

1.2.4 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，使用Design Expert 12.0.3.0軟件設計四因素三水平的Box-Behnken響應面實驗，以總黃酮得率為響應值進行優化，因素水平見表1。

表1 BBD實驗因素與水平設計Table 1 BBD experiment design of factor and level

1.2.5 總黃酮得率的測定[19]采用 NaNO2-Al（NO3）3分光光度法測定總黃酮，稱取干燥至恒定質量的蘆丁標準品30.0 mg，無水乙醇溶解定容于10 mL容量瓶，得到3.0 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 上述溶液至 10 mL容量瓶，稀釋至5 mL，加入0.5 mL的0.05 g/mL亞硝酸鈉，搖勻放置6 min，再加入0.5 mL的（0.1 g/mL）硝酸鋁，再搖勻放置6 min，再加入4 mL的0.04 g/mL氫氧化鈉并定容至10 mL，搖勻放置5 min。過微孔膜過并于510 nm處測量吸光度，測量三次。以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標擬合得到標準曲線：Y=10.74857X-0.0416，R2=0.9993，表明蘆丁在0.03～0.18 mg/mL呈良好的線性關系。樣品總黃酮的測定：取樣品溶液0.2 mL按照上述方法顯色測量得到吸光度，根據標準曲線計算得到對應總黃酮濃度，得率計算公式如下：

式中：Y表示鐵皮石斛總黃酮得率，mg/g；c表示根據吸光度值計算出的溶液質量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數；V表示供試品溶液體積，mL；m表示取樣量，g。

1.2.6 總黃酮回收和DESs循環利用 采用AB-8、ADS-8、D101三種大孔樹脂進行總黃酮回收實驗。取最優條件下的總黃酮提取液4 mL，分別加入大孔樹脂0.75和1.50 g，在25 ℃下置于搖床上振蕩12 h（100 r/min），取其上清液測定吸附率。針對最佳吸附率的樹脂進行進一步實驗。濾液DESs再次用于鐵皮石斛花樣品提取，測量并計算重復利用率。過濾得到大孔樹脂置于30 mL甲醇中解吸附6 h（25 ℃，100 r/min），取解吸液測定解吸率。相關計算公式如下：

式中：c0、c1、c2分別為提取液、吸附平衡液、解吸平衡液的總黃酮濃度，mg/mL；V0、V2分別為提取液、解吸平衡液的體積，mL；Y1、Y2分別為初次得率和二次得率，mg/g；A、D、R分別為吸附率、解吸率、重復利用率。

1.3 數據處理

實驗均平行重復三次，實驗數據使用Design Expert 12.0.3.0軟件處理，采用方差分析進行多重比較。模型的擬合度參考回歸系數R2，R2越接近1表示模型越準確，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 DESs組成對總黃酮得率的影響

不同氫鍵供體與氯化膽堿形成的DESs間的溶解性、黏度、表面張力差異，對于黃酮類物質的提取效率有著重要影響[20]。為選擇最優的低共熔溶劑，在固定提取溫度（50 ℃）、時間（30 min）、液固比（20:1 mL/g）的前提下，比較了常見的5種DESs在不同摩爾比下的得率。結果如表2所示，比較不同氫鍵供體可以發現，氯化膽堿-乳酸DESs總黃酮得率低于其他，這是由于黃酮化合物主要是通過與溶劑形成分子間氫鍵來促進溶解的[21]，而C=O電負性較大與多苯環結構的黃酮化合物產生排斥影響氫鍵穩定性。另外，-O-H-O-氫鍵強度高于-N-H-N-，所以多元醇DESs的得率高于尿素。然而丙三醇DESs黏度較大，使黃酮化合物擴散阻力增大，所以得率也較低。乙二醇和1,2-丙二醇DESs得率隨著摩爾比先增高后降低，并在1:4時達到最大值。當氯化膽堿：乙二醇為1:4時，得率達到13.757 mg/g，高于其他DESs，因此選擇氯化膽堿-乙二醇（1:4）作為最優的DESs進行后續實驗。

表2 不同DESs對鐵皮石斛總黃酮得率的影響Table 2 Yield of total flavonoids of Dendrobium officinale by different DESs

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 不同含水量DESs對得率的影響 通過含水量可以調節DESs的極性、黏度，進而影響黃酮化合物的溶解性[22]。如圖1所示，總黃酮得率隨水比例先升高至14.786 mg/g（20%）后逐漸降低至11.685 mg/g（80%）。這是由于少量的水能夠起到降低DES黏度，增大極性的作用，促進黃酮化合物的溶解。而極性過大也不利于黃酮溶解。所以選擇20% DESs含水量作為最佳水平。

圖1 不同含水量DESs的總黃酮得率Fig.1 Total flavonoids yield of DESs with different water contents

2.2.2 不同提取溫度對總黃酮得率的影響 增加DESs溫度能夠降低其黏度，從而促進溶質擴散[23]。結果如圖2所示，在40～70 ℃總黃酮得率緩慢上升，70～90 ℃迅速上升至17.360 mg/g，隨后逐漸下降。原因可能是低于70 ℃時，DESs與黃酮化合物氫鍵結合較弱，不利于黃酮化合物的溶出，而90 ℃以上的高溫則會使黃酮化合物的穩定性降低。因此選擇90 ℃作為最佳提取溫度。

圖2 不同溫度下DESs的總黃酮得率Fig.2 Total flavonoids yield of DESs at different temperatures

2.2.3 不同液固比對總黃酮得率的影響 增大DESs用量使得樣品周圍的黃酮濃度能夠快速降低，從而始終保持較大的濃度差，有利于黃酮物質的溶出。結果如圖3所示，得率隨著液固比增大而迅速增加。當達到20:1 mL/g時，得率增加量較少，在30:1 mL/g時達到最大值17.538 mg/g。之后再增加溶劑，得率變化不大甚至有所降低，因此從節約溶劑角度考慮，選擇液固比為20:1 mL/g為最佳水平較為合適。

圖3 不同液固比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on the total flavonoids yield

2.2.4 不同提取時間對總黃酮得率的影響 如圖4所示，鐵皮石斛花總黃酮得率隨著提取時間延長而逐漸增大，并在40 min達到最大值；當時間超過40 min后，得率呈現急劇下降的趨勢。這是由于初期隨著反應進行，黃酮化合物充分溶出并達到平衡，而提取時間過長可能會導致黃酮化合物與其他物質反應，或者黃酮本身穩定性降低，使得率降低。因此選擇40 min作為最佳提取時間。

圖4 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

2.3 響應面實驗結果分析

2.3.1 模型建立及方差分析 響應面試驗設計使用BBD設計方法，包括4個因素、3個水平和5個重復數據評估模型穩定性。試驗設計條件及結果如表3所示。通過對表3中的數據進行回歸分析得到表4中的模型方差分析結果。分析得到的回歸方程為：

表3 BBD設計試驗與結果Table 3 Result of BBD design experiment

由表4的方差分析可知，所得模型極顯著（F=29.75，P＜0.0001），失擬度極不顯著（F=0.46，P＞0.5），表明該模型回歸極為顯著。R2=0.9875，RAdj2=0.9650，說明鐵皮石斛花總黃酮得率的實驗值與預測值有良好擬合度，具有較好的回歸性。精密度17.9749＞4進一步體現模型的準確性。比較各個因素F值、P值可以看出，其對于總黃酮得率的影響順序為X3＞X2＞X1＞X4。DESs含水量（X1）、提取溫度（X2）、液固比（X3）對總黃酮提取工藝的影響極顯著（P＜0.01），提取時間（X4）的影響顯著（P＜0.05）；提取溫度、液固比交互項對于響應值影響顯著（P＜0.05），其他交互項均不顯著；平方項均達到極顯著水平（P＜0.01）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance

2.3.2 響應面分析 響應面的三維等高線圖可以反映兩因素之間的交互作用，曲面越傾斜則表明兩者交互作用越顯著。X1、X2、X3、X4對鐵皮石斛花總黃酮得率的影響如圖5所示，可以看出液固比分別與提取溫度、時間的交互作用較強，這與方差分析中X2X3、X3X4兩項P值較低相符。根據擬合方程和方差分析結果得到的最優提取條件為：X1=18.9%，X2=88.2 ℃，X3=23.3:1 mL/g，X4=38.0 min，預測得率為23.152 mg/g。為檢驗該模型的準確程度，在最優條件下進行實驗，得到的總黃酮得率實測值為（22.457±0.412） mg/g，表明該模型準確，對鐵皮石斛花總黃酮的提取工藝優化具有指導意義。

圖5 各因素交互作用對總黃酮得率的響應面圖Fig.5 Response surface graph of the of the interaction of various factors on the yield of total flavonoids

2.4 總黃酮的回收和DESs循環利用

DESs的一個重要優點就是便于重復利用。目前主要使用超臨界CO2萃取[24]、固相萃取[25]、色譜[26]等方法回收提取物來再生溶劑，此類方法成本較高且操作復雜。而大孔樹脂吸附法被認為是一種簡便而高效的方法，被普遍用于回收DESs[27-28]。本研究采用AB-8、ADS-8、D101三種不同類型大孔樹脂來吸附DESs中的黃酮成分，來研究黃酮成分的回收和DESs的重復利用性能，結果如圖6所示。結果表明，三種樹脂吸附率均較好，且隨著樹脂用量增加，吸附效果越好。在相同吸附劑用量條件下，吸附效果順序為 ADS-8＞D101＞AB-8，其中 ADS-8在用量為1.5 g時，吸附率達到78.32%。另外，采用甲醇對吸附飽和的ADS-8進行解吸附，解吸附率為83.55%。

圖6 不同類型樹脂對DESs中總黃酮吸附率的影響Fig.6 Adsorption rate of different resins for total flavonoids in DESs

DESs經過大孔樹脂吸附后，可循環利用。在最優實驗條件下ADS-8吸附后的DESs再次用于提取鐵皮石斛花總黃酮時，其得率為（16.792±0.434） mg/g，扣除吸附不完全帶來的背景影響，其回收利用率達到95.47%。因此，DESs使用大孔吸附樹脂回收后，性質穩定溶解性保持較好，可重復利用，是一種綠色優良的提取溶劑。

目前，文獻報道的鐵皮石斛花總黃酮提取主要使用乙醇[29-30]作為溶劑。由表5可以看出傳統提取方法的提取效果均低于本文中DESs最佳得率（22.457 mg/g）。并且DESs提取步驟更為簡便，所用溶劑量少，對環境污染小，所以DESs提取鐵皮石斛花黃酮是一種高效而綠色的提取工藝，能充分利用鐵皮石斛中的有效成分。

表5 不同提取方法對鐵皮石斛花黃酮得率Table 5 Yield of flavonoids from Dendrobium officinale flowers by different methods

3 結論

本文研究了鐵皮石斛花總黃酮的綠色DESs提取工藝。比較溶劑組成發現最佳溶劑組成為氯化膽堿和乙二醇（1:4），氫鍵類型和HBD官能團對總黃酮得率有重要影響。使用BBD-RSM方法建立的模型R2=0.9875，優化得到的最佳條件為：DESs含水量18.9%，提取溫度88.2 ℃，液固比23.3:1 mL/g，提取時間38.0 min，預測得率為23.152 mg/g，實際得率22.457 mg/g，模型預測準確可靠。大孔樹脂ADS-8處理后的DESs對總黃酮仍具有較高的得率，回收利用率達95.47%。與傳統有機溶劑相比，該方法更加高效且綠色，溶劑實現重復利用，是一種具有工業應用前景的提取工藝。該研究對鐵皮石斛活性物質的綠色提取具有指導意義，為深入開發新型鐵皮石斛制品提供一定的理論基礎。