酶法水解牦牛皮蛋白制備抗氧化肽工藝的優化

李 露，張普香，韓朋岑，李金容，葉瀟瑩，蔡韜敏，Isaac Newton ODEI ASARE，龍曉燕

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010）

抗氧化肽是近年來被廣泛研究的一類天然生物活性肽，作為一種天然抗氧化劑，其結構相對簡單、易吸收、穩定性好、無免疫反應，不僅具有較強的抗氧化活性，還具有降血壓和抗癌等其他保健功效，在食品和醫療保健品領域越來越受到人們的關注[1]。動物皮中含有的蛋白質是天然抗氧化肽的原料來源之一，目前已有較多通過酶法水解方法從豬皮[2]、鴨皮[3]、雞皮[4]、魚皮[5-6]、蟾蜍皮[7]等動物皮膚中提取出具有抗氧化活性多肽。我國是世界上牦牛飼養量最大的國家，飼養牦牛總數約1400多萬頭，主要分布于青海、西藏、四川等地，其中青海飼養量占30%以上，位居全國第一[8]。牦牛主要生活在高寒地區，能采食各種高原上的植物和多樣名貴藥材，因此牦牛皮相關的產品具有較高的營養價值，如牦牛奶中的蛋白質、脂肪、礦物質元素等營養物質是中國荷斯坦牛乳的2倍[9]。牦牛皮是牦牛相關產品加工的副產物，研究表明，牦牛皮中粗蛋白占牦牛皮干重的89.74%，而膠原蛋白占粗蛋白含量的85%，相比普通蛋白質，膠原蛋白具有更好的生物相容性、促凝血性、弱抗原性和可降解性，也更容易被人體吸收利用，因此，牦牛皮可以作為天然活性肽的原料[10-11]。但牦牛皮的加工利用大多集中在皮革行業，僅有少部分被用于提取牦牛皮膠原蛋白，再由酶法提取出膠原蛋白肽[12-13]，不理想的抗氧化活性及復雜的工藝降低了牦牛皮蛋白的利用率。

因為清除DPPH自由基能力的測定方法能夠涉及到單電子轉移（SET）的直接還原和氫原子轉移（HAT）的兩種抗氧化肽清除自由基的機制來猝滅自由基[14]，故將其作為評價牦牛皮蛋白水解物抗氧化能力的指標。本文采用堿性蛋白酶酶法水解制備牦牛皮抗氧化肽，先研究pH、水解溫度、酶用量、底物濃度及水解時間對牦牛皮蛋白水解物的影響，再結合響應面（Box-Behnken）試驗設計，根據牦牛皮水蛋白解度（DH）及DPPH自由基清除能力的IC50值篩選牦牛皮抗氧化肽的最佳制備工藝，為牦牛皮的開發和應用提供試驗支撐和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛皮 來自青海省某大型屠宰場；DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基） 梯希愛化成工業發展有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；茚三酮 上海易恩化學技術有限公司；抗壞血酸、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、無水乙醇等分析純試劑成都市科隆化學品有限公司。

AR124CN電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；DZRW-D-1型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司；Dynamica Velocity 14R臺式離心機 青島浩賽科技股份有限公司；UDK129半自動凱氏定氮儀 VELP公司；雷磁PHS-3C電極PH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛皮抗氧化肽制備工藝 除去牦牛皮上肉、筋膜、牛毛等物質，稱取牦牛皮，以烘干后牦牛皮重量的質量體積比1:20與蒸餾水混合，用0.1 mol/L的NaOH調節溶液pH為8.5，根據不同底物濃度加入不同質量的堿性蛋白酶，調節相應的水解溫度、水解時間，恒溫水浴攪拌進行水解，90 ℃水浴滅活10 min，4 ℃、10000 r/min離心 10 min后得到牦牛皮抗氧化體，真空冷凍干燥后于-20 ℃下保存。

1.2.2 單因素實驗 每次單因素實驗稱取5 g處理好的牦牛皮，以水解度（DH）和DPPH自由基清除能力為評價指標分別考察五個單因素對水解度及DPPH自由基清除率的IC50值影響。

1.2.2.1 不同pH對牦牛皮水解的影響 在酶用量10000 U/g、水解溫度50 ℃、水解時間8 h、底物濃度 5%的水解條件下考察不同 pH（7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）對水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.2 不同水解溫度對牦牛皮水解的影響 酶用量10000 U/g、底物濃度5%、水解時間8 h、pH8.5的水解條件下考察不同水解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.3 不同酶用量對牦牛皮水解的影響 在底物濃度5%、水解溫度50 ℃、水解時間8 h、pH8.5的水解條件下考察不同酶用量（4000、6000、8000、10000、12000 U/g）對水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.4 不同底物濃度對牦牛皮水解的影響 在酶用量 10000 U/g、水解溫度 50 ℃、水解時間 8 h、pH8.5的水解條件下考察不同底物濃度（3%、4%、5%、6%、7%）對水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.5 不同水解時間對牦牛皮水解的影響 在酶用量 10000 U/g、水解溫度 50 ℃、底物濃度 5%、pH8.5的水解條件下考察不同水解時間（4、6、8、10、12 h）對水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上，運用軟件設計專家（Design-Expert 8.0.6）中的響應面優化設計，選取三個單因素：A（水解溫度，℃）、B（酶用量，U/g）、C（水解時間，h）為自變量，以牦牛皮水解物的水解度和DPPH自由基清除率的IC50值為響應值進行酶解工藝條件優化。響應面因素水平編碼見表1。

表1 響應面因素水平編碼Table 1 Factor level coding of response surface

1.2.4 水解度（DH）測定 分別測α-氨基酸態氮含量（α-Aminonitrogen，AN）與總氮含量（Totalnitrogen，TN）來計算水解度，AN采用茚三酮顯色法，用甘氨酸配制標準溶液繪制標準曲線來進行測量計算α-氨基酸態氮含量[15]；TN采用中華人民共和國國家標準《食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5-2010）中的凱氏定氮法測定計算總氮含量。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測定 采用文獻[16-17]的方法并略微改進，將不同濃度的牦牛皮蛋白水解物溶液2.0 mL與0.1 mmol/L DPPH自由基溶液2.0 mL混合，充分振蕩，避光孵育30 min（25 ℃），于波長517 nm測得混合溶液的吸光值Ai；對照組用2.0 mL蒸餾水替代酶解溶液測得吸光值A0；空白組以2.0 mL無水乙醇替代DPPH溶液測得吸光值Aj；VC作為陽性對照，并計算牦牛皮抗氧化肽對DPPH自由基清除率的IC50值。

1.2.6 ABTS+自由基清除能力的測定 采用Yap等[18]的方法并略微改進，配制含有7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀的ABTS試劑，在室溫下孵育12～16 h。在734 nm下用無水乙醇稀釋為吸收值為0.700±0.005。取ABTS自由基陽離子工作液3.9 mL與0.1 mL不同濃度的牦牛皮抗氧化肽溶液混合，充分振蕩，23 ℃避光孵育6 min，測定混合溶液在波長734 nm處的吸光值Ai，無水乙醇做空白對照測得吸光值A0，VC作為陽性對照，并計算牦牛皮抗氧化肽對ABTS自由基清除率的IC50值。

1.2.7 羥自由基清除能力的測定 采用文獻[19-20]的方法做略微改進，2 mL不同質量濃度的牦牛皮抗氧化肽溶液置于10 mL具塞試管中，再加入2 mL的過氧化氫溶液（6 mmol/L）和2 mL硫酸亞鐵（6 mmol/L）溶液，充分振蕩后在避光處靜置30 min，再向離心管中加入剛配制好的2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L），振蕩混勻，25 ℃環境下靜置10 min，于510 nm處測定反應混合溶液的吸光度值Ai，空白對照用蒸餾水代替樣品測得吸光度值A0，蒸餾水代替水楊酸溶液測得吸光度值為Aj，VC作為陽性對照，并計算牦牛皮抗氧化肽對羥自由基清除率的IC50值。

1.2.8 還原力測定 取0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）2.5 mL、1%（w/v）鐵氰化鉀溶液 2.5 mL與不同濃度的牦牛皮抗氧化肽溶液1 mL混勻，充分振蕩，50 ℃ 孵育 20 min，迅速冷卻，加入 10%（w/v）三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，充分振蕩，5000 r/min離心10 min，取上層清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL及0.1%（w/v）三氯化鐵溶液0.5 mL，振蕩混勻，該混合物在室溫下保持10 min，測定其在波長700 nm處的吸光度，VC作為陽性對照。吸光度值越大，表示水解物的還原能力越強。

1.3 數據處理

使用Design-Expert 8.0.6進行響應面設計，實驗結果用Orgin 8.0和IBM SPSS Statistics 26軟件進行統計分析，抗氧化活性實驗中IC50值由IBM SPSS Statistics 26軟件進行計算。其中P＜0.05說明差異顯著，P＜0.01說明差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 pH對牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖1所示，隨著pH的逐漸增加，水解度呈現出先緩慢上升后趨于平緩的變化趨勢；不同pH條件下的牦牛皮抗氧化肽對DPPH自由基清除率的IC50值變化趨勢與水解度相關，當溶液pH在處于7～8.5時，水解度由34.26%±0.52%增加到 35.99%±0.73%，但 pH進一步增加時，水解度不再上升、IC50值不再降低，這可能是由于堿性蛋白酶是一種一般在pH6～10時比較穩定，在低于6或高于11時會很快失活，最適作用pH范圍在7～11的酶類[21]。結合圖中兩個指標的變化趨勢說明水解度與DPPH自由基清除率的IC50值之間存在著一定的關系，一定程度上IC50值能隨著水解度的增大而減小，在pH7.5～9.5的范圍內，pH對牦牛皮抗氧化肽的制備沒有顯著性影響。在pH 8.5時，水解度能達到最大值35.99%±0.73%，IC50達到最小值為2.965 mg/mL，在牦牛皮抗氧化肽為濃度8 mg/mL時對DPPH自由基的清除率是93.83%±0.86%。故在后續實驗選擇pH8.5作為使用堿性蛋白酶水解牦牛皮蛋白的最佳pH。

圖1 pH對牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.1 Effects of pH on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.2 水解溫度對牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖2所示，伴隨水解溫度逐步上升，水解度呈現出先上升后下降的變化趨勢，當溫度從45 ℃升高到50 ℃時，水解度隨溫度的升高出現最大值（P＜0.05）；DPPH自由基清除率的IC50值呈現出先減小后增加的變化趨勢，當溫度升高到50 ℃時，IC50值隨溫度的升高出現最小值（P＜0.05）。本實驗所用堿性蛋白酶的最適反應溫度約為40～55 ℃，酶促反應中不同酶的最適溫度不同，當低于最適溫度時，酶的相關性質發生改變，催化活性受到抑制后使其對底物的水解作用降低；而當溫度升到一定限度時，酶結構會發生不可逆的改變，從而失去催化活性[22]。所以在50 ℃之前，隨溫度增加，水解度也在顯著增加（P＜0.05），同時牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值也在降低，在50 ℃之后兩者都出現不同程度的變化，并且大部分堿性蛋白酶多由微生物分泌的特點是耐熱性不佳，加熱可能會使酶活性受到損失[23]。結合圖中兩個指標的變化趨勢說明溫度在50 ℃時兩個指標達到最佳，水解物在濃度8 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為89.34%±0.82%，IC50值為3.172 mg/mL；牦牛皮水解度為30.36%±0.70%。結合實驗結果，選擇45 ～55 ℃作為后續響應面試驗條件。

圖2 溫度對牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.2 Effects of temperature on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.3 酶用量對牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖3所示，隨著酶用量從4000 U/g增加到12000 U/g，水解度呈現出先上升后趨于不變的變化走向，DPPH自由基清除率的IC50值呈現出先減小后不變的變化趨勢。酶用量達到10000 U/g處，水解度出現顯著提高（P＜0.05）、IC50值出現顯著降低（P＜0.05），此時牦牛皮抗氧化肽在濃度為8 mg/mL時對DPPH自由基清除率是 95.88%±0.83%，IC50值為 3.061 mg/mL；水解度為36.82%±1.98%。在這之后隨著酶用量增加到12000 U/g，對DPPH自由基清除率的IC50值和水解度趨于不變。由于在底物濃度一定的條件下，酶促反應速率會和酶濃度呈正比，伴隨加酶量增加，水解反應速率加快，水不溶性的蛋白在蛋白酶的作用下逐漸被切割成小分子肽段[24]。但酶的用量超過其與底物充分反應所需數值時，隨著酶用量的增加，蛋白質不發生更為強烈的水解，也不會產生更多的活性肽及活性官能團[25]。因此隨著酶用量的增加，水解度呈現出先增后緩的變化趨勢。結合圖圖中兩個指標的變化趨勢選擇最適的酶用量為8000～12000 U/g進行后續響應面實驗。

圖3 酶用量對牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.4 底物濃度對牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖4所示，隨底物濃度的增加，水解度呈現出緩慢增大后緩慢減小變化趨勢，在4%～7%內差異不太明顯；從圖4中可以看出牦牛皮抗氧化肽在不同的底物濃度下，DPPH自由基清除率的IC50值呈現出先減小后趨于不變的走向。在底物濃度為5%時，兩者都達到最佳，牦牛皮抗氧化肽在濃度8 mg/mL時對DPPH自由基清除率達到93.41%±0.86%，IC50值為2.936 mg/mL；水解度為35.25%±1.71%，但當底物濃度進一步增加時，兩者趨于不變。可能是由于酶與底物的接觸機率隨底物濃度的增加可擴大，充分發揮堿性蛋白酶對牦牛皮蛋白的水解作用，產生數量更多的抗氧化物質；底物濃度不停增大時，在超越了酶的作用范圍后，酶對牦牛皮蛋白的水解作用及水解程度均不同程度的受到限制而減弱，使得水解物的抗氧化活性及水解度出現降低現象[26]。結合圖中兩個指標的變化趨勢，在底物濃度4%～6%范圍內，對牦牛皮抗氧化肽的制備工藝無顯著性影響（P＞0.05），但在底物濃度為5%時水解度與IC50值能取得最佳值，故選擇最佳底物濃度5%作為后續實驗條件。

圖4 底物濃度對牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.4 Effects of substrate concentration on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.5 水解時間對牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖5所示，隨時間的增加，水解度呈現先增加后趨于不變的變化趨勢，對水解度（DH）的影響比較顯著（P＜0.05）；牦牛皮抗氧化肽在不同的時間下，DPPH自由基清除率的IC50值呈現出先減小后趨于不變的走向。水解時間從4 h增加到10 h時，兩個指標隨時間出現不同程度的變化，在此之后隨時間的增加，兩者趨于平緩不變。水解時間不斷增加，酶對底物的水解作用更充分，會產生更多的肽片段和氨基酸殘基，因此水解度會出現較大幅度的增加；同時水解物中產生了更多的抗氧化物質，故而呈現出更高的自由基清除活性。但是多肽的抗氧化活性與其肽段長度、構象以及氨基酸組成等因素有關[27]。隨水解時間的增加，酶的持續水解會影響牦牛皮蛋白水解產物中的肽段氨基酸組成和構象，深度水解會破壞抗氧化肽的結構從而會影響到水解物的抗氧化活性[28]。結合圖中兩個指標的變化趨勢，在水解時間為10 h時，兩者都達到最佳值，牦牛皮抗氧化肽在濃度8 mg/mL時對DPPH自由基清除率達到95.62%±2.37%，IC50值為2.979 mg/mL；牦牛皮水解度為37.31%±0.23%。不同的水解時間對牦牛皮抗氧化肽的制備工藝影響較明顯，因此，選取水解時間8～12 h進行后續響應面實驗。

圖5 水解時間對牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.5 Effects of hydrolysis time on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面設計及結果 根據單因素的實驗結果，選擇A（水解溫度）、B（酶用量）和C（水解時間）這3個單因素為自變量，酶解后的水解度（DH）和對DPPH自由基清除率的IC50值為響應值，使用Box-Behnken進行試驗設計，相應的響應面試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

2.2.2 響應面模型的建立與分析 運用Design Expert 8.06軟件對數據分析并進行多元回歸擬合，以溫度、酶用量和時間三個單因素為自變量，以水解度為響應面響應值，得到的二元回歸方程為：Y1=38.18+2.50A+2.13B+1.20C-1.05AB-0.78AC-0.17BC-5.91A2-2.16B2-1.71C2；以牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值為響應面響應值，得到的二元回歸方程為：Y2=3.01-0.23A-0.22B-0.13C+0.22AB-0.036AC+0.11BC+0.91A2+0.17B2+0.32C2。方差分析結果見表3、表4。

表3 水解度回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of hydrolysis degree regression model

表4 DPPH自由基清除率IC50值回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of DPPH free radical scavenging rate IC50 value regression model

由表3可知水解度的回歸模型F值為58.61，P＜0.01，失擬項P=0.4629＞0.05，說明所得模型極顯著，模型失擬項不顯著，得到的回歸方程的擬合度較高；模型決定系數R2=0.9869，調整系數R2Adj=0.9701，說明該模型可以解釋97.01%的響應值變化，該模型的水解度的實測值和預測值良好，回歸方程可以用來分析與預測酶法水解制備牦牛皮抗氧化肽的工藝結果。同時模型中A、B、C、A2、B2和C2對水解度都有極顯著的影響（P＜0.01），AB對水解度的影響顯著（P＜0.05），其余不顯著（P＞0.05）。通過方差分析中F值的大小可評價各因素對指標的影響程度，F值越大影響越顯著[29]。因此對工藝的影響順序依次為：水解溫度＞酶用量＞水解時間。

由表4可知牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基IC50值的回歸模型F值為45.22，P＜0.01，失擬項P=0.2441＞0.05，說明所得模型極顯著，模型失擬項不顯著，得到的回歸方程的擬合度較高；模型相關系數R2=0.9831，調整系數R2Adj=0.9614，說明該模型可以解釋96.14%的響應值變化，該模型的牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基IC50值的實測值和預測值良好，所得的回歸方程可以用于分析與預測酶法水解制備牦牛皮抗氧化肽的工藝結果。模型中A、B、AB、A2、C2對牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基IC50值都有極顯著的影響（P＜0.01），C和B2對牦牛皮水解物的DPPH自由基清除率IC50值影響顯著（P＜0.05）。依據F值大小能夠得出對工藝的影響順序依次為：溫度＞酶用量＞時間。

2.2.3 響應面各因素交互作用分析 響應曲面坡度和凹凸程度能夠反映各因素對牦牛皮抗氧化肽提取的影響大小[30]，三維響應面的坡度陡峭和曲率越大則說明兩因素的交互作用對響應值的影響顯著，如果坡度相對比較平緩，則表示當兩因素的交互作用對響應值變化影響較小[31-32]。兩因素之間的交互作用對響應值的影響如圖6所示。由圖6a～圖6c可以看出，圖6a響應曲面陡峭，等高線密集，說明溫度與酶用量的交互作用對響應值的影響顯著。在因素水平范圍內溫度和酶用量交互作用的顯著程度大于時間與溫度和時間與酶用量。從圖6d～圖6f響應面的坡度與等高線的密集程度可知，溫度和酶用量的交互作用對響應值的影響相對于溫度與時間、酶用量與時間的交互作用更為顯著。

圖6 各因素交互對水解度及對DPPH自由基清除率IC50值影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the interaction of various factors on the degree of hydrolysis and the IC50 value of DPPH radical scavenging rate

2.2.4 最佳工藝條件確定及驗證 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析回歸模型，得到水解牦牛皮抗氧化肽的最佳工藝條件為：水解溫度50.77 ℃，酶用量10889.68 U/g，水解時間10.59 h。為進一步確定最佳工藝，結合單因素實驗結果對試驗參數進行進一步優化，得到的實際最佳工藝為：水解溫度51 ℃，酶用量 10890 U/g，水解時間 10.6 h，pH8.5，底物濃度5%。預測的水解度為39.02%、清除DPPH自由基的IC50值為2.953 mg/mL。進行三次驗證試驗，得到實際水解度為41.39%±0.69%，與預測值相差5.73%；牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值為2.884 mg/mL，與預測值相差2.34%，牦牛皮抗氧化肽濃度為8 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達到92.73%±0.47%。兩者實測值均接近預測值，說明該響應面模型得到的參數可靠。

2.3 牦牛皮抗氧化肽體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 從圖7a中可知，VC對DPPH 自由基有顯著清除作用（P＜0.05） ，VC水溶液在1～12 mg/mL范圍內各濃度之間對DPPH自由基清除率無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比牦牛皮抗氧化肽對DPPH自由基有較好的清除活性，在濃度為8～12 mg/mL時清除率比較接近VC，并且不再增加（P＞0.05）。牦牛皮抗氧化肽濃度為8 mg/mL時達到最大DPPH自由基清除率，為92.73%±0.47%，其清除DPPH自由基的IC50值為2.884 mg/mL，根據從動物中提取的抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值來看，海參性腺水解物IC50為3.39 mg/mL[33]、南極磷蝦多肽IC50為5.65 mg/mL[34]、豬肩胛骨酶解液IC50為4.59 mg/mL[35]，對比結合本實驗所得牦牛皮抗氧化肽的DPPH自由基清除率IC50值，可以表明其具有較好的抗氧化活性。

圖7 不同濃度下牦牛皮抗氧化肽的體外抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of yak hide antioxidant peptides in vitro at different concentrations

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 由圖7b可知，VC對ABTS+自由基有顯著清除作用，VC水溶液在1～12 mg/mL范圍內各濃度之間對ABTS+自由基清除率無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比，牦牛皮抗氧化肽對ABTS+自由基有較好的清除活性，在濃度為1～10 mg/mL時，清除率隨濃度的增加出現明顯增長（P＜0.05），呈現出劑量-效應關系，并在濃度為 10～12 mg/mL 時清除率趨于平緩，不再增加（P＞0.05），牦牛皮抗氧化肽濃度為10 mg/mL時，最大ABTS+自由基清除率為89.58%±1.11%，其清除ABTS+自由基的IC50值為2.110 mg/mL。

2.3.3 羥自由基清除能力 由圖7c可知，VC對羥自由基有顯著的清除作用，VC水溶液在1～12 mg/mL范圍內各濃度之間對羥自由基清除率無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比牦牛皮抗氧化肽對羥自由基有較強的清除活性，在濃度從1增加到8 mg/mL時清除率隨濃度的增加出現顯著增長（P＜0.05），呈現出明顯的劑量-效應關系，并在濃度為10～12 mg/mL時趨于不變，無顯著性差異（P＞0.05），在牦牛皮抗氧化肽濃度為8 mg/mL時達到最大清除率90.05%±0.13%，其清除羥自由基的IC50值為2.523 mg/mL。

2.3.4 還原能力 由圖7d可知，VC水溶液在 1～5 mg/mL范圍內的吸光度值出現顯著上升（P＜0.05），5 mg/mL之后吸光度值不再增加，各濃度之間無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比牦牛皮抗氧化肽的還原能力，在濃度從1 mg/mL增加到12 mg/mL時吸光度值隨濃度的增加呈現顯著上升趨勢（P＜0.05），說明隨濃度增加反應體系中普魯士藍的生成量在增多，也能說明牦牛皮抗氧化肽具有一定的還原能力。

3 結論

本實驗以牦牛皮蛋白為原料，在單因素實驗基礎上，結合響應面法建立酶法水解牦牛皮蛋白制備抗氧化肽工藝的回歸模型，所得到的模型顯著，回歸方程擬合度較好。并通過對回歸方程的分析解決多變量問題，尋找最佳水解工藝，經分析兩者對水解工藝的影響程度均為：溫度＞酶用量＞時間。得到的最佳水解工藝為：水解溫度51 ℃，酶用量10890 U/g，水解時間10.6 h，pH8.5，底物濃度5%，此工藝條件下的實際水解度為41.39%±0.69%、對DPPH自由基清除率IC50值為2.884 mg/mL，水解物濃度8 mg/mL時對DPPH自由基清除率達到92.73%±0.47%，與預測值接近，表明通過響應面分析得到的回歸方程能較好地預測試驗結果。

通過體外的抗氧化活性實驗，牦牛皮抗氧化肽對DPPH·、ABTS+·和羥自由基的清除率的 IC50值分別為2.884、2.110、2.523 mg/mL，并且還原能力也較強，這可以表明提取的牦牛皮抗氧化肽具有良好的抗氧化能力，可以作為天然抗氧化肽的原料來源。