快速測(cè)試片與國標(biāo)方法測(cè)試脫鹽乳清粉中金黃色葡萄球菌的對(duì)比

杜雅正，劉洪梅，安雪征, ，祁 娜

（1.中國食品添加劑和配料協(xié)會(huì), 北京 100020；2.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司, 北京 100176）

乳清粉是干酪生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，主要成分是乳糖和乳清蛋白[1-6]。脫鹽乳清粉顧名思義是將乳清粉進(jìn)行脫鹽處理，是嬰兒配方乳粉的主要原料。在我國脫鹽乳清粉慢慢由進(jìn)口開始轉(zhuǎn)變?yōu)橐M(jìn)技術(shù)自主生產(chǎn)，通過控制脫鹽乳清粉的質(zhì)量，保證下游嬰兒配方乳粉的安全，脫鹽乳清粉營養(yǎng)素含量變化上基本保持穩(wěn)定，蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖營養(yǎng)素含量很穩(wěn)定，給微生物的生長提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)[7-10]。目前對(duì)脫鹽乳清粉每個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和危害分析后，形成了危害分析及危害評(píng)估表，金黃色葡萄球菌污染是常見的危害之一。

自然界中葡萄球菌屬至少包括有20個(gè)種。金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬是一種病原菌，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37 ℃，最適生長pH7.4，其會(huì)引發(fā)人或動(dòng)物許多嚴(yán)重性感染[11-17]。典型的金黃色葡萄球菌為球形，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性，是一種不利于人體的細(xì)菌。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，因此，生產(chǎn)加工過程中受其污染的機(jī)會(huì)很多，因金黃色葡萄球菌引起的感染僅次于大腸桿菌排在第二位，引發(fā)的中毒事件很多[18-20]。因此，在各個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的加工過程中對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了嚴(yán)格的控制管理，快速、準(zhǔn)確的獲得檢測(cè)結(jié)果顯得尤為重要。

對(duì)于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，目前有國標(biāo)法、測(cè)試片法、試劑盒法、生物分子學(xué)方法和免疫學(xué)方法。國標(biāo)法即以GB 4789.10-2016依據(jù)的檢測(cè)方法，通過Baird-Parker平板培養(yǎng)，其檢測(cè)步驟較為繁瑣，觀察相對(duì)耗時(shí)，較難滿足企業(yè)生產(chǎn)加工時(shí)食品安全的及時(shí)性檢測(cè)需要以及突發(fā)性食物中毒的檢測(cè)需要。免疫學(xué)方法操作簡單且成本低廉，但會(huì)受到食品本身基質(zhì)及非金黃色葡萄球菌的影響，在檢測(cè)上有局限性。分子生物方法操作簡單且靈敏度高，但在引物設(shè)計(jì)上較為復(fù)雜。測(cè)試片法是近年來使用較廣的方法，通過與微生物代謝的顯色反應(yīng)測(cè)定食品中微生物的含量，操作較簡便，價(jià)格較低廉，測(cè)試周期短，效率高[21-26]。本研究使用國標(biāo)法和快速測(cè)試片法對(duì)脫鹽乳清粉中金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比研究，旨在探求較快速準(zhǔn)確檢測(cè)脫鹽乳清粉金黃色葡萄球菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清粉（D90）A 恒天然集團(tuán)；乳清粉（D90）B愛爾蘭Dairygolg公司；乳清粉（D70）C 愛沙尼亞Epiim公司，共18個(gè)批次的脫鹽乳清粉進(jìn)行比對(duì)研究；直徑90 mm無菌培養(yǎng)皿、Baird-Parker瓊脂平板

北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司；3MTMPetrifilmTM金黃色葡萄球菌測(cè)試片[27]（STX） 3M中國有限公司提供；金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌株 上海林淵生物科技有限公司。為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果符合國標(biāo)的結(jié)果計(jì)算要求，一個(gè)稀釋度的平板典型菌落數(shù)控制在20～200 CFU/g之間，如果樣品的金黃色葡萄球菌菌數(shù)量小于150 CFU/g，則需添加標(biāo)準(zhǔn)菌株，制備人為污染樣品。

BMJ-250恒溫培養(yǎng)箱 28±1 ℃，上海博訊醫(yī)療生物有限公司；ME2002/E電子天平 感量為0.01 g，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；400cc均質(zhì)器、SCAN100菌落計(jì)數(shù)器 法國英特賽恩斯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的準(zhǔn)備 采用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，用接種環(huán)挑取一環(huán)凍存菌株于BHI肉湯中培養(yǎng)24 h，混勻，做梯度稀釋，為了方便讀取結(jié)果，在1:10和1:100兩個(gè)稀釋度都有一定數(shù)量的菌落生長，選擇金黃色葡萄球菌的數(shù)量控制在150～1500 CFU/g的菌懸液。

1.2.2 乳清粉樣液的制備 稱取25 g乳清粉至盛有225 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，制成1:10的樣品勻液。然后添加制備好的菌懸液1 mL到制備好的1:10乳清粉樣品勻液，充分混合。

1.2.3 乳清粉樣液的稀釋 用1 mL微量移液器吸取1:10乳清粉樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

1.2.4 接種與培養(yǎng)

1.2.4.1 測(cè)試片法 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按照國標(biāo)方法中對(duì)于稀釋度的要求，選擇1:10和1:100兩個(gè)稀釋度的樣品勻液，將測(cè)試片置于平坦表面處，揭開上層膜，使用吸管將1 mL樣液垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜蓋下。將壓板置于上層膜中央壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面上。拿起壓板，靜置至少1 min使培養(yǎng)基凝固。

將測(cè)試片的透明面朝上，可堆疊至多不超過20片，置于36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄24±2 h的結(jié)果。如果上述測(cè)試片上出現(xiàn)暗紫紅色（典型的金黃色葡萄球菌特征），無需進(jìn)行確認(rèn)；如果測(cè)試片上出現(xiàn)黑色、藍(lán)綠色菌落或紫紅色菌落不明顯，需使用確認(rèn)反應(yīng)片做進(jìn)一步確認(rèn)。將上層膜掀起，將確認(rèn)反應(yīng)片置入測(cè)試片的培養(yǎng)范圍內(nèi)，再將上層膜放下覆蓋在確認(rèn)反應(yīng)片上，用手指以滑動(dòng)的方式輕輕與確認(rèn)反應(yīng)片緊密接觸并除去氣泡，最后把插入確認(rèn)反應(yīng)片的測(cè)試片放在36±1 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～3 h。如出現(xiàn)粉紅色環(huán)，判定為金黃色葡萄球菌。

1.2.4.2 國標(biāo)法 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker瓊脂平板，然后用無菌涂布棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25～50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失[27]。

在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36±1 ℃培養(yǎng)1 h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置后于36±1 ℃培養(yǎng) 24～48 h。

1.2.4.3 樣品本底試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)考慮是否進(jìn)行人工污染樣品，對(duì)全部18個(gè)樣品進(jìn)行了測(cè)試，分別采用GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第二法金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法和快速測(cè)試片（3M快速測(cè)試片）檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)。

1.2.5 適應(yīng)性試驗(yàn) 人工污染樣品，選擇1:10和1:100兩個(gè)稀釋度，吸取 1 mL金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌懸液，加入1:10的樣品勻液內(nèi)，渦旋混勻以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，用無菌涂布棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣，倒置平板于36±1 ℃培養(yǎng)48 h，觀察標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長狀況和計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 參考ISO 4833-1：2013標(biāo)準(zhǔn)中準(zhǔn)確度的要求[28]，對(duì)重復(fù)性進(jìn)行考察，以短時(shí)間內(nèi)同一人員使用相同場(chǎng)地、設(shè)備、方法測(cè)試兩次，兩次測(cè)試計(jì)數(shù)結(jié)果的對(duì)數(shù)值的絕對(duì)相差R≤0.25。

按照金黃色葡萄球菌測(cè)試片方法進(jìn)行測(cè)試，觀察兩次測(cè)量結(jié)果。

1.2.7 對(duì)比試驗(yàn) 分別向18個(gè)樣品勻液內(nèi)加入1 mL金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌株的菌懸液，渦旋混勻，制成待測(cè)樣液，每個(gè)待測(cè)樣液分別用GB 4789.10-2016和快速測(cè)試片的方法進(jìn)行測(cè)試，獲得數(shù)據(jù)結(jié)果使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析[29-30]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，用SPSS Statistics 22.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品考察結(jié)果

篩選的具有代表性的18個(gè)樣品分別采用兩種方法測(cè)試，Baird-Parker平板和快速測(cè)試片在10-1稀釋度下均無菌落生長。由此可見，全部樣品需要使用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)其進(jìn)行人工污染。結(jié)果見表1。

表1 脫鹽乳清粉樣品本底實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Background test results of desalted whey powder

Baird-Parker平板和快速測(cè)試片在10-1稀釋度下均無菌落生長，測(cè)試結(jié)果以＜10 CFU/g報(bào)出。

2.2 適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)樣品勻液進(jìn)行人工污染，樣品勻液中金黃色葡萄球菌的添加量范圍在15～150 CFU/g，經(jīng)過36±1 ℃培養(yǎng)48 h后，結(jié)果如表2所示。金黃色葡萄球菌分別在Baird-Parker平板和快速測(cè)試片上體現(xiàn)的菌落生長情況，如表3所描述，此結(jié)果可以看出金黃色葡萄球菌ATCC 25923在脫鹽乳清粉樣品基質(zhì)下生長未被抑制，生長情況正常。

表2 人工污染測(cè)試結(jié)果Table 2 Artificial pollution test results

表3 金黃色葡萄球菌形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of Staphylococcus aureus

2.3 快速測(cè)試片的重復(fù)性

在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，兩次測(cè)試間隔1 h，使用相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材，同一名實(shí)驗(yàn)員使用相同方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，測(cè)試依據(jù)參照ISO 4833-1：2013對(duì)準(zhǔn)確度重復(fù)性的要求，重復(fù)性限r(nóng)≤0.25，結(jié)果見表4。每個(gè)樣品測(cè)試結(jié)果均在可接受范圍內(nèi)，由此可以得出結(jié)論兩次測(cè)試重復(fù)性良好。

表4 精密度測(cè)試結(jié)果Table 4 Precision test results

2.4 國標(biāo)方法和快速測(cè)試片法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如表5所示，18份脫鹽乳清粉中金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的檢測(cè)結(jié)果，使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，對(duì)兩組獨(dú)立樣本從結(jié)果看出t=0.19，金黃色葡萄球菌測(cè)試項(xiàng)目t≤t（0.05/2,34），說明經(jīng)t檢驗(yàn)得知該測(cè)試項(xiàng)目的兩組結(jié)果沒有顯著性差異，兩種方法針對(duì)該樣品的檢測(cè)結(jié)果具有很好的一致性。

表5 兩種方法測(cè)試結(jié)果的比對(duì)Table 5 Comparison of test results of two methods

3 結(jié)論

本研究采用快速測(cè)試片法與國標(biāo)方法針對(duì)脫鹽乳清粉樣品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)對(duì)比，本底實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品中金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)結(jié)果均＜10 CFU/g，需要人工污染樣品來進(jìn)行方法研究，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)菌株在兩種方法培養(yǎng)基上的生長狀況良好，菌落特征明顯。依據(jù)ISO 4833-1：2013對(duì)重復(fù)性的要求，考慮快速測(cè)試片方法的重復(fù)性結(jié)果，將第二次和第一次測(cè)試結(jié)果值進(jìn)行比較，取其lg值均在重復(fù)性限r(nóng)≤0.25的范圍之內(nèi)，快速測(cè)試片的使用可滿足標(biāo)準(zhǔn)對(duì)重復(fù)性的要求。對(duì)兩種方法的對(duì)比數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性研究，使用t檢驗(yàn)驗(yàn)證無顯著性差異，對(duì)比結(jié)果有著良好的一致性。本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，按照方法培養(yǎng)24 h，測(cè)試片上生長的菌落直徑較小，暗紫紅色現(xiàn)象不明顯，需要繼續(xù)再培養(yǎng)12 h以上，可明顯識(shí)別出來。國標(biāo)方法需要進(jìn)行革蘭氏染色和血漿凝固酶鑒定試驗(yàn)，鑒定試驗(yàn)操作培養(yǎng)時(shí)間在24 h以上，觀察相對(duì)耗時(shí)，測(cè)試片不需要進(jìn)行單獨(dú)的鑒定。綜上所述，快速測(cè)試片法適用于食品配料脫鹽乳清粉的金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的檢測(cè)，具有方法簡便，產(chǎn)品性能穩(wěn)定，檢測(cè)效率高的優(yōu)點(diǎn)。