UPLC-Q/Orbitrap HRMS測定白酒中氨基甲酸乙酯含量的不確定度分析

楊軍林，程平言，蔣力力，馮小兵，熊曉通，尹艷艷，胡 峰，汪地強，鐘方達

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司, 貴州遵義 564622）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）作為廣泛存在于發酵食品（乳酪、面包、酸奶等）和酒精飲料（葡萄酒、威士忌、蒸餾酒）中的2A類致癌物質[1-3]，是威脅飲酒人群健康安全的潛在因素之一；其次，在肝臟清除上，乙醇與EC很有可能存在較為復雜的交互反應，故攝入體內的乙醇與EC具有一定的協同致癌效果[4]；還有證據表明，長期接觸EC可能會導致神經系統紊亂[5-6]。因此，目前有些國家已制定了EC在蒸餾酒中的相關限量標準[7-8]；但國內尚未制定白酒中EC的相關限量標準，為了有效監測白酒中EC含量問題，白酒生產企業及部分科研院所相繼開發了薄層色譜法、傅里葉變換近紅外光譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、高效液相色譜-熒光檢測器法以及高效液相色譜-質譜法等監測手段[9]。為了確保實驗檢測結果的可信度，對其進行測量不確定度的分析具有必要性，目前僅有氣質聯用法的不確定度評價方法已見報道[10]，而高效液相色譜-質譜法測定白酒中EC時具有前處理操作簡便、抗干擾能力強等優點[11-16]，但對其不確定度的評價研究尚屬于空白，同時，考慮了將實驗準確度和精密度作為不確定度的來源之一。

為了客觀公正地表示測定結果，需要引入測量不確定度，測量不確定度分析是實驗檢測過程和實驗室質量控制中的必要部分，同樣，此舉也具有相當重要的意義。測量不確定度可有效表征合理地賦予被測量值的分散性，并可對實驗檢驗結果進行合格判定，同樣，也可用于開發新檢測方法、實驗室認證等方面[17-30]。本研究依據GB/T 27148-2017《測量不確定度評定與表示》[31]和JJF 1135-2005《化學分析測量不確定度評定》[32]中的相關規定，結合UPLCQ/Orbitrap HRMS測定白酒中EC含量[16]的不確定度分析，以期為實驗室開發新檢測方法、CNAS認證、質量控制提供科學、準確的理論依據，同時為測量白酒中其他有毒有害物質的不確定度分析提供參考，進而確保實驗室檢測結果的權威性與公正性，更好地保障白酒的食品安全與質量品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒樣 貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司醬香成品酒；氨基甲酸乙酯標準品（純度99.4%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸 色譜純，美國Fisher公司。

Q Exactive Focus 液質聯用儀（配有電噴霧離子源（HESI）及Thermo Xcalibur 2.2數據處理系統）美國Thermo Fisher公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀 美國Thermo Dionex公司；AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；艾科浦超純水機 美國Aquaplore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 參考熊曉通等[16]的試驗方法，略作改進，準確吸取1 mL酒樣于10 mL刻度試管中，在85 ℃烘箱中烘至0.2～0.4 mL后取出，冷卻至室溫后加超純水定容至1 mL，渦旋混勻，0.22 μm水相濾膜過濾后，待上機檢測。

1.2.2 超高效液相色譜-高分辨質譜分析 色譜柱：AccucoreaQ 液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；進樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；流動相：A為0.1%（v/v）甲酸水溶液，D為甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，維持 5% D；1～4 min，5% D 線性變至95% D；4～5.5 min，維持 95% D；5.5～6 min，95% D線性變至5% D；6～10 min，線性變至5%D。

離子源：電噴霧離子化正離子模式；掃描類型：SIM模式；離子源溫度：350 ℃；毛細管電壓：2.3 kV；毛細管溫度：200 ℃；S-lens RF level：80；鞘氣流速：30 arb；輔助氣流速：15 arb；AGC target：1×106；一級質譜全掃描分辨率：70000；C-trap最大注入時間：5 ms；掃描范圍：55～95 m/z。

1.2.3 數學模型的建立 通過儀器可得標準溶液的峰面積，并經最小二乘法線性擬合可得標準曲線，待測EC質量濃度由標準曲線計算可知。影響各不確定度來源之間的相關因素采取多元回歸分析，確定多個變量的因果關系，以建立預測的數學模型[20]。

白酒中EC含量計算公式見式（1）：

式中：X—表示試樣中EC的含量，μg/L；C—表示標準工作曲線中得到的EC的質量濃度，ng/mL；V1—表示試樣溶液最終定容體積，mL；V0—表示試樣溶液所代表試樣的取樣體積，mL。

1.3 數據處理

通過儀器Thermo Xcalibur 2.2數據處理系統進行數據分析，并結合Excel軟件擬合實驗標準曲線。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

依據建立的數學模型，并對白酒中EC的測定結果有影響的各不確定度分量進行全面分析和量化，如，樣品處理過程（包括樣品量取、最終定容）、標準工作系列溶液配制（包括標準物質的純度、標準溶液的配制以及標準曲線的擬合）、重復性實驗、精密度、準確度等，并考慮了測定儀器以及實驗溫度變化引起的不確定度，具體引入的不確定因素如圖1所示。

圖1 白酒中EC測定不確定度因素來源分析Fig.1 Analysis of source of uncertainty factors in EC of the Chinese baijiu

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品前處理及上機引起的不確定度u（C1）

2.2.1.1 量取樣品產生的不確定度u（V0） 用1000 μL移液器準確吸取 1 mL酒樣（V0），參考 JJG 646-2006《移液器檢定規程》[33]的要求，按B類評定，其1000 μL移液器的容量允差為±1.0%，假設按均勻分布，其不確定度是：若測量重復性為0.5%，其不確定度是：0.00289；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度是：量取樣品產生的不確定度和相對不確定度分別為

2.2.1.2 樣品前處理后定容引入的不確定度u（V1） 樣品經過部分揮發后用超純水定容至V1為1 mL，按B類評定，其10 mL刻度試管的容量允差為±0.008 mL，假設按均勻分布，其不確定度是：=0.00462；若溫度波動范圍為±5 ℃，則

2.2.1.3 儀器自動進樣引入的不確定度（儀器進樣針容積）u（V2） 參考文獻 [21,23]，UPLC-Q/Orbitrap HRMS自動進樣器配置的進樣針容積的相對標準偏差為±1%，假設按矩形分布，則0.0058。

綜上所得，合成樣品前處理及儀器自動上機引起的相對不確定為：

2.2.2 EC質量濃度引入的不確定度u（C2）

2.2.2.1 配制EC儲備液產生的不確定度u（C2-1）參考文獻[21,23]，準確稱取標準品EC（m）8.0 mg（純度99.4%），超純水溶解后移至100 mL容量瓶并定容（80 mg/L）。根據EC標準證書得純度（p）誤差是±0.7%，假設按均勻分布，則根據AR2140電子天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.1 mg，假設按均勻分布，則由玻璃量器的相關規定可知[34]，在（20±5）℃ 溫度范圍下 100 mL A 級容量瓶容量允差為±0.1 mL，假設為矩形分布，則定容體積引入的不確定度：溶劑的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，假設按均勻分布，則由溫度變化引起的不確定度為：故合成100 mL容量瓶定容體積引入的相對不確定度為：因此，其配制過程產生的相對不確定度為：

2.2.2.2 稀釋儲備液產生的不確定度u（C2-2） 用1 mL分度吸量管移取1 mL EC儲備液于100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度可得質量濃度為1 mg/L的標準溶液，并依次稀釋可得質量濃度為0.1 mg/L的標準溶液。按B類評定，假設按均勻分布，結合相關標準的規定[34-35]，其計算結果見表1。

表1 稀釋過程引入的不確定Table 1 Uncertainty arising by the dilution process

則稀釋過程產生的相對不確定度為：

2.2.2.3 配制標準系列溶液產生的不確定度u（C2-3）用1 mL和2 mL分度吸量管移取0.2、0.5、1和2 mL標準溶液（0.1和1 mg/L）于10 mL容量管中并定容，可配得標準系列溶液為5、10、20、50、100、200 μg/L。根據玻璃量器的檢定要求[35]，按B類評定，如表2所示。則其引入的相對不確定度為：

表2 配制過程引入的不確定度Table 2 Uncertainty arising by the configuration process

2.2.2.4 標準曲線擬合引入的不確定度u（C2-4） 參考文獻[20-21,25,28]，將配制的6種不同質量濃度的標準系列溶液過0.22 μm水相微孔濾膜后直接上機檢測，各取10 μL分別重復進樣3次，采用最小二乘法擬合標準工作溶液的質量濃度（Ci）與峰面積（Ri）間標準曲線，如表3所示。取一陽性酒樣，重復測定8次，結果見表4，則擬合標準曲線產生的不確定度按式（2）～式（7）計算：

表3 擬合標準曲線Table 3 Fitting standard curves

表4 陽性酒樣測定數據Table 4 Datas of determination of positive Chinese baijiu

式中：B1為斜率；B0為截距；Ri表示第i次測定標準溶液中EC的峰面積；Ci表示第i次測定標準溶液中EC的質量濃度；p為對陽性酒樣的測定次數（p=8）；n為6個標準系列溶液重復測定3次的總次數（n=18）；C0為陽性酒樣中EC的平均值；為 標準溶液中EC的平均質量濃度，計算結果見表5。

表5 擬合標準曲線引入的不確定度分量Table 5 Results of uncertainty arising by standard curves fitting

則由EC質量濃度產生的相對不確定度為：

2.2.3 重復性實驗引起的不確定度u（C3） 參考文獻[20,21,23]，取一已知質量濃度的陽性基質樣品，添加水平為50 μg/L的標準溶液，按前處理方法測定，重復測定10次，考察其重復性和回收率產生的相對不確定度。

參考文獻[27-29]，取一已知質量濃度的陽性基質樣品，添加水平為50 μg/L的標準溶液，按前處理方法測定，通過3位分析人員分別測定待測物的質量濃度，每人重復測定3次；同樣，取一已知質量濃度的陽性基質樣品，添加水平為50 μg/L的標準溶液，按前處理方法測定待測物的質量濃度，每天重復測定3次，重復測定6 d，考察其精密度和準確度產生的相對不確定度。

2.2.3.1 測量重復性產生的不確定度u（C3-1） 通過測定重復性試驗，代入公式計算可得，如表6所示。

2.2.3.2 加標回收率R產生的不確定度u（C3-2） 測定加標回收率R如表6所示，按A類評定，其回收率引入的不確定度和相對不確定度由平均回收率、標準偏差 S (R)的結果分別代入公式可得。

表6 重復性試驗測定結果Table 6 Results of determination of repeatability tests

2.2.3.3 測量精密度產生的不確定度u（C3-3） 由式（8）～式（12）計算可得精密度產生的不確定度和相對不確定度如表7和表8所示。

表7 不同天數測定結果Table 7 Results of determination by different days

式中：S (φ1)表示同一測試人員不同天數測定所得結果的標準偏差；n1為同一測試人員不同天數測定次數（n1=6×3=18）； φˉ1表示同一測試人員不同天數測定所得結果的平均值；S (φ2)表示不同測試人員同一天測定所得結果的標準偏差；n2為不同測試人員同一天測定（n2=3×3=9）；φ ˉ2表示不同測試人員同一天測定所得結果的平均值。

則由精密度產生的相對不確定度為：urel（C3-3）=0.0338。

2.2.3.4 測量準確度產生的不確定度u（C3-4） 由式（13）～式（17）計算可得準確度產生的不確定度和相對不確定度如表7和表8所示。

表8 不同測試人員測定結果Table 8 Results of determination by different analysts

式中：S (η1)表示同一測試人員不同天數測定所得結果回收率的標準偏差；ηˉ1表示同一測試人員不同天數測定所得結果回收率的平均值；S (η2)表示不同測試人員同一天測定所得結果回收率的標準偏差；ηˉ2表示不同測試人員同一天測定所得結果回收率的平均值。

則準確度產生的相對不確定度：urel（C3-4）=0.0339。

綜上所得，由測量重復性、回收率、精密度以及準確度引起的合成不確定度經計算為：urel(C3)=

2.3 合成不確定度

若不考慮各不確定度的相關性，則結合UPLCQ/Orbitrap HRMS測定白酒中EC含量的合成不確定度由公式計算。

2.4 擴展不確定度及結果表示

通過CNAS-GL006:2019《化學分析中不確定度的評估指南》[30]和JJF 1135-2005《化學分析測量不確定度評定》[32]的相關要求，在95%置信區間下，對于大量檢測分析均選用包含因子k=2來衡量，則由公式計算UPLC-Q/Orbitrap HRMS測定白酒中EC含量的擴展不確定度。因此，其不確定度分析評估結果見表9。

表9 UPLC-Q/Orbitrap HRMS測定白酒中EC含量的不確定度評估結果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination of EC in Chinese Baijiu by UPLC-Q/Orbitrap HRMS

3 結論

通過UPLC-Q/Orbitrap HRMS測定白酒中EC含量的不確定度評估過程可知，整個試驗操作過程均可或高或低的引入不確定度。本研究全面地對標準溶液配制及標準曲線擬合、實驗前處理過程、重復性試驗等因素進行綜合考慮，分析結果可知，最主要的不確定度來源從高到低依次為試驗準確度、精密度、標準曲線擬合以及標準溶液配制，而試驗重復性、回收率、樣品量取及體積定容引入的不確定度相對較低。故在后續試驗操作過程中，可考慮減少人員的操作及盡量減少間隔長時間測定，同時，采取增加標準曲線工作溶液，保持所用儀器良好的穩定性能，并對標準溶液和使用儀器定期開展校準或檢定活動，同時，不斷加強實驗員的操作技能等途徑，以達到降低實驗過程中的不確定度，從而實現新開發方法可用性和檢測結果可信度的實驗要求。