紫色馬鈴薯花青素的抑菌性及其對草莓保鮮效果的研究

張海霞，包 良

（1.呼和浩特職業學院, 內蒙古呼和浩特 010051；2.內蒙古醫科大學民族醫藥創新中心, 內蒙古自治區中蒙藥重點實驗室, 內蒙古呼和浩特 010010）

花青素是存在于植物中的水溶性黃酮多酚類化合物[1-2]，可以起到抑菌、防突變、降血糖等作用[3]，廣泛應用于醫藥保健品和食品、化妝品中[4-5]。紫色馬鈴薯種植技術成熟，在我國的馬鈴薯主、次產區都有種植，產量大，其塊莖富含花青素，提取花青素具有來源豐富，生產成本低等優點[6]，具有較好的開發前景。戴妙妙等[7]發現紫娟茶中花青素對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌能力。陳嬋等[8]報道紫甘薯原花青素對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，但是目前對紫色馬鈴薯花青素抑菌性和防腐性方面的報道較少。

關于草莓保鮮，目前廣泛應用化學和生物保鮮法，孫娜等[9]對五葉草莓保鮮性研究發現，采用1%殼聚糖處理保鮮效果最好，趙亞珠等[10]用百里香精油制備抗菌紙箱儲藏草莓，能較好保持草莓的感官品質。本試驗研究紫色馬鈴薯花青素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌菌和酵母菌的抑菌性，并對紫色馬鈴薯花青素與對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨和結合使用的抑菌效果對比。同時對紫色馬鈴薯花青素對草莓的保鮮性能進行了探討，以期為紫色馬鈴薯花青素作為生物抑菌劑和保鮮劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色馬鈴薯“黑美人” 采收于內蒙古武川縣；草莓 采摘于呼和浩特討思浩種植大棚；LB培養基、PDA培養基、醋酸、氯化鉀、醋酸鈉、無水乙醇、磷酸、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀 均為分析純，內蒙古愛爾法生物科技公司；大腸桿菌、酵母菌、青霉菌和金黃色葡萄球菌呼和浩特職業學院生化實驗室提供。

H/716M高速臺式離心機機 湖南赫西儀器公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-ID超凈工作臺 天津科賽特實驗室設備有限公司；WZS20折光儀 上海圣科儀器設備有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DPX-9272生化培養箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫色馬鈴薯花青素的提取 取紫色馬鈴薯用自來水沖洗干凈削去表皮，切成薄片，干燥至恒重，打碎成粉末，過濾，收集篩下物。參照李玲等[11]的方法提取花青素，適當進行調整。稱取10 g紫色馬鈴薯粉末放于圓底蒸餾燒瓶與一定體積的1%酸化乙醇提取液按照液料比為20:1（mL/g）混勻，提取溫度65 ℃、超聲功率300 W條件下浸提。獲得的浸提液4500 r/min離心，萃取、蒸發、濃縮、真空干燥后得花青素提取物[12]，配制成 55、45、35、25、22.5、15、11.25、5.625、2.8125、1.40625 mg/mL 待用。

1.2.2 抑菌試驗

1.2.2.1 菌懸液的制備 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌轉接至LB固體培養基表面，放置于培養箱中37 ℃培養24～36 h[13]；青霉菌和酵母菌接種于PDA培養基28 ℃培養48 h；活化后將上述供試菌接種在相應的液體培養基中，恒溫振蕩培養10～24 h左右[14]。調整各種菌懸液濃度為105CFU/mL待用。以下各處理均進行3次重復。

1.2.2.2 紫色馬鈴薯花青素的抑菌性 通過濾紙擴散法形成的抑菌區域直徑大小來評估紫色馬鈴薯花青素的抑菌效果。取上述菌懸液0.01 mL接種于各培養基平板上[15]；將濾紙打成直徑6 mm圓形小片，置潔凈小盒內高壓滅菌，待其干燥后分別放入濃度為15、25、35、45和55 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素溶液中浸泡20 min，瀝干放入上述接菌培養板上，倒置培養箱內37 ℃恒溫培養24 h，測量每種處理抑菌區域直徑[1]。

1.2.2.3 最低抑菌濃度（MlC） 采用二倍稀釋法，配制紫色馬鈴薯花青素水溶液，濃度分別為45、22.5、11.25、5.625、2.8125、1.40625 mg/mL，把滅菌后的濾紙片放入其中浸泡20 min，瀝干放入1.2.2.2各接菌培養板上，37 ℃恒溫培養24 h后，測量每種處理抑菌區域直徑。判斷依據是無抑菌圈出現的最低濃度為紫色馬鈴薯花青素的最低抑菌濃度[16]。

1.2.2.4 紫色馬鈴薯花青素與對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨和結合使用的抑菌效果對比 將高壓蒸汽滅菌的濾紙片分別浸泡于25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素溶液、25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+0.5 μg/mL對羥基苯甲酸乙酯溶液（體積比1:1）、25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+5 μg/mL山梨酸鉀溶液（體積比1:1）、0.5 μg/mL對羥基苯甲酸乙酯溶液、5 μg/mL山梨酸鉀紫色馬鈴薯花青素溶液，浸泡20 min，瀝干放入1.2.2.1各接菌培養板上，測量每種處理抑菌區域直徑來判斷抑菌差異性。

1.2.3 紫色馬鈴薯花青素對草莓的保鮮性試驗

1.2.3.1 草莓處理 鑒于對羥基苯甲酸乙酯是一種廣譜型食品添加劑，可應用于多種類型物質的保鮮，以下實驗采用對羥基苯甲酸乙酯和花青素作為保鮮劑。取成熟度一致、果型相似、無損傷新鮮草莓120個，分成4組，稱重。3組草莓分別用25 mg/mL紫色馬鈴薯花青素溶液、0.5 μg/mL對羥基苯甲酸乙酯溶液、25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+0.5 μg/mL對羥基苯甲酸乙酯混合液（體積比為1:1）浸泡10 min；以蒸餾水處理的一組為對照CK。各組處理后放于干凈濾紙吸干水分，用厚度為0.1 mm的普通PE保鮮膜單層包裝，室溫（26±2 ℃）保藏[4]，每隔 24 h 測定以下參數，共檢測5 d。所測參數均重復3次，分別取其均值。

1.2.3.2 失重率 采用稱重法計算1.2.3.1中4組草莓的失重率[9]。

式中：M0為處理前的質量，g；Mi為第i天的質量，g。

1.2.3.3 腐爛率 方法參考文獻[17]，草莓果肉有褐變、表面有霉斑或腐爛汁水流出判定為腐爛。統計

1.2.3.1 中4組草莓的腐爛率。

1.2.3.4 可溶性固形物含量（Brix值） 取1.2.3.1中4組草莓各10 g，研碎取汁用雙層紗布過濾，用手持折光儀測定草莓汁不同處理條件下的Brix值。

1.2.3.5 菌落總數測定 參照GB 4789.2-2016[18]《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》的方法對1.2.3.1中4組草莓菌落總數測定。

1.3 數據處理

本實驗數據統計和作圖采用Excel 2010；顯著性分析采用SPSS Statistics 18.0和GraphPad8軟件分析。表中抑菌區直徑為三次平行的均值±標準偏差，包含抑菌濾紙片直徑6 mm。

2 結果與分析

2.1 紫色馬鈴薯花青素對供試菌的抑菌性

2.1.1 紫色馬鈴薯花青素對不同供試菌的抑菌作用從表1可以看出，紫色馬鈴薯花青素對供試菌的抑制效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞青霉菌＞酵母菌。酵母菌對紫色馬鈴薯花青素不敏感，只有花青素溶液為高濃度時才會起作用，與陳虎[19]的研究結論一致。前三種供試菌隨著紫色馬鈴薯花青素濃度提高,抑菌區直徑都在增大，說明高濃度花青素有利于增強抑菌效果。當紫色馬鈴薯花青素濃度為55 mg/mL時，金黃色葡萄球菌的抑菌區直徑可達到15.73 mm。

表1 不同濃度紫色馬鈴薯花青素對供試菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of purple potato anthocyanins at different concentrations on the tested bacteria

2.1.2 紫色馬鈴薯花青素對不同供試菌的最低抑菌濃度（MIC） 根據表2得到，紫色馬鈴薯花青素對供試四種菌的最低抑菌濃度分別為11.25、5.625、22.5和45 mg/mL。在花青素濃度為45 mg/mL時，酵母菌的抑菌區直徑僅為6.27 mm，低于青霉菌的抑菌區直徑8.20 mm，但兩者抑菌區直徑都小于10 mm，說明紫色馬鈴薯花青素對青霉菌和酵母菌的生長有影響，但作用效果不顯著（P＞0.05），再次證明酵母菌對花青素不敏感。

表2 紫色馬鈴薯花青素對供試菌的最低抑菌濃度（MIC）Table 2 MIC of purple potato anthocyanin solution on the tested bacteria

2.1.3 紫色馬鈴薯花青素與對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨和結合使用的抑菌效果對比 根據表3得出，紫色馬鈴薯花青素對前三種供試菌均具有抑制作用；對羥基苯甲酸乙酯和山梨酸鉀對供試四種菌都有影響；當紫色馬鈴薯花青素分別與對羥基苯甲酸乙酯和山梨酸鉀混合使用時，前三種供試菌的抑菌區直徑都明顯大于用單一試劑處理的抑菌區直徑，說明花青素有助于增強抑菌效果，青霉菌的抑菌區直徑可達到40.87 mm，增強效果最明顯；酵母菌的抑菌區直徑變化不明顯。

表3 紫色馬鈴薯花青素與對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨和結合使用抑菌效果對比Table 3 Comparison of antibacterial effects of purple potato anthocyanin, ethylparaben and potassium sorbate alone and in combination

2.2 紫色馬鈴薯花青素對草莓的保鮮作用

2.2.1 紫色馬鈴薯花青素對草莓腐爛率的影響 從圖1可以看出，采用不同方式處理的草莓腐爛率有明顯差異。CK從貯藏的第2 d腐爛率明顯升高，腐爛率顯著高于另外三組（P＜0.05）。4 d后，對照草莓、花青素處理草莓、對羥基苯甲酸乙酯處理草莓、花青素和對羥基苯甲酸乙酯混合液處理草莓腐爛率分別為79.7%、70.2%、50.0%和43.1%，表明處理過的草莓腐爛率顯著低于未處理草莓（P＜0.05）。用紫色馬鈴薯花青素和對羥基苯甲酸乙酯混合處理的草莓在試驗期內各階段腐爛率顯著低于花青素處理組（P＜0.05）。這可能是由于花青素的強抗氧化特性影響細菌的代謝反應[20]，能抑制微生物的生長，但是紫色馬鈴薯花青素單獨使用時對草莓腐爛率的影響小于對羥基苯甲酸乙酯。

圖1 不同處理對草莓腐爛率的影響Fig.1 Influence of different treatments on strawberry decay rate

2.2.2 紫色馬鈴薯花青素對草莓失重率的影響 草莓在貯藏中由于水分的蒸發和營養物質消耗，會影響其外觀品質和口感。由圖2可以看出，在儲藏1～5 d，各組草莓重量都有不同程度的變化。對照CK失重率上升幅度最高達到23.09%；其次是A、B和C。說明不同處理方法在一定程度上能減緩草莓果實中水分的流失。單獨用花青素處理和對羥基苯甲酸乙酯處理后草莓失重率在第2、4和5 d差異不顯著（P＞0.05）；用花青素和對羥基苯甲酸乙酯復合處理組效果最佳，失重率顯著低于其它各處理組（P＜0.05）。

圖2 不同處理對草莓貯藏失重率的影響Fig.2 Influence of different treatments on the rate of weight loss in strawberry storage

2.2.3 紫色馬鈴薯花青素對草莓可溶性固形物含量的影響 可溶性固形物含量（Brix值）是反映果實營養價值及判斷果實耐貯藏能力的重要指標[21-23]。根據圖3得到，在1～5 d，所有處理組草莓Brix值都在減少，可能是果實自身呼吸作用消耗糖分而使Brix值下降[17]?；ㄇ嗨?對羥基苯甲酸乙酯混合處理組草莓第1 d時Brix值為19.4%，第5 d時Brix值為13.2%，降低幅度為6.2%，顯著低于對羥基苯甲酸處理組和花青素處理組（P＜0.05）；對照草莓的Brix值降低幅度最多達到13.4%，顯著高于其它組（P＜0.05）。這可能是因為保鮮劑形成的透明薄膜，抑制了草莓采后貯藏期的呼吸作用[24]，減緩Brix值下降速度，延長貨架期。用花青素處理的草莓Brix高于對照CK，但低于對羥基苯甲酸乙酯處理，說明花青素在一定程度上可以抑制脫離母體的草莓果實的呼吸作用，但是單獨使用效果有限。

圖3 不同處理對草莓可溶性固形物含量的影響Fig.3 Influence of different treatments on the soluble solid content of strawberry

2.2.4 紫色馬鈴薯花青素對草莓菌落數的影響 如圖4所示,隨著貯藏時間的延長，各組草莓菌落總數都出現升高趨勢。其中第1 d花青素+對羥基苯甲酸乙酯混合處理的草莓菌落總數最低（3.91 lg CFU/g），花青素處理草莓菌落數（4.41 lg CFU/g）低于對照CK（4.54 lg CFU/g）,但差異不顯著（P＞0.05）。第 2、3和5 d時，對羥基苯甲酸乙酯處理草莓菌落數顯著低于對照CK（P＜0.001），花青素+對羥基苯甲酸乙酯混合處理草莓菌落數極顯著低于對照CK（P＜0.0001），說明花青素能有效增強對羥基苯甲酸乙酯的抑菌效果。總體來看，紫色馬鈴薯花青素對草莓菌落數有影響，但效果差于對羥基苯甲酸乙酯和紫色馬鈴薯花青素+對羥基苯甲酸乙酯。

圖4 不同處理對草莓菌落總數的影響Fig.4 Influence of different treatments on the total number of strawberry colonies

3 結論

本試驗結果表明紫色馬鈴薯花青素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌的生長有抑制作用。對大腸桿菌桿菌和金黃色葡萄球菌的作用較好，青霉菌次之；只有花青素為高濃度時才會對酵母菌產生一定的抑制作用。紫色馬鈴薯花青素對四種供試菌的最低抑菌濃度（MIC）依次為 11.25、5.625、22.5和45 mg/mL。25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素與對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀結合使用有助于增強抑菌效果，從紫色馬鈴薯中提取的花青素可做為安全、無毒的生物抑菌性深度開發，與化學抑菌劑協同使用，可降低化學藥劑的使用劑量，應用于食品和藥品中。

紫色馬鈴薯花青素對草莓具有一定保鮮效果。用25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+0.5 μg/mL對羥基苯甲酸乙酯混合液處理組草莓的失重率、腐敗率顯著低于對照CK（P＜0.05），可溶性固形物含量顯著高于對照CK（P＜0.05），菌落總數極顯著低于對照CK（P＜0.0001）。保鮮能力依次為對羥基苯甲酸乙酯+花青素＞對羥基苯甲酸乙酯＞花青素。說明紫色馬鈴薯花青素在一定程度上能抑制草莓水分的散失，減緩草莓呼吸速度，延長儲藏時間，起到保鮮劑的作用，但其效果有效，與對羥基苯甲酸聯合使用效果最佳。微生物安全是食品中的關鍵問題[25-26]。相比于化學保鮮防腐劑，花青素用作保鮮劑，天然、安全并節約成本，二者聯用可為新型環保生物防腐劑的開發提供一種新思路。