糖苷結(jié)構(gòu)對(duì)苦蕎黃酮促進(jìn)葡萄糖在C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞中攝取作用的影響

吳偉菁，仇 菊 ，吳蘭蘭，朱 宏，馬國(guó)宇，謝 文

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361023；2.天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建廈門 361023；3.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361018；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081）

苦蕎 （Fagopyrum tataricum） 富含黃酮類物質(zhì)，含量為6.65～22.27 mg/g，其中蘆丁占90%以上[1-2]。雖然，苦蕎中的黃酮以蘆丁為主[3-4]。由于苦蕎含有蘆丁降解酶，蘆丁降解酶遇水可立即將苦蕎中的雙糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮-蘆丁降解為黃酮前體-槲皮素[5]。通過(guò)提前熱處理進(jìn)行滅酶，能夠保護(hù)苦蕎中的蘆丁不被降解[6]。因此，不同加工順序會(huì)對(duì)苦蕎黃酮類化合物的組成產(chǎn)生影響[6]。另外，苦蕎黃酮提取物通過(guò)添加柚苷酶、高壓并加入α-L-鼠李糖苷酶，可將蘆丁轉(zhuǎn)化為單糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮-異槲皮素[7-8]。因此，對(duì)比苦蕎中蘆丁及降解產(chǎn)物之間的活性[2]（三者的結(jié)構(gòu)如圖1），有助于闡明不同加工方式對(duì)苦蕎黃酮的營(yíng)養(yǎng)成分保持及功效活性的影響，進(jìn)而選擇合適的苦蕎加工技術(shù)[9]。

圖1 槲皮素（Q）、異槲皮素（I）及蘆丁（R）的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of quercetin(Q), isoquercetin(I) and rutin(R)

不同糖苷結(jié)構(gòu)的苦蕎黃酮具有不同的生物活性。蘆丁及其降解產(chǎn)物（異槲皮素及槲皮素）具有抑制碳水化合物消化酶的作用[10-12]，槲皮素比蘆丁和異槲皮素具有更高的抑制活性。但在一定的濃度范圍內(nèi)，蘆丁和異槲皮素則無(wú)顯著性差異[11]。也有研究表明，槲皮素能夠直接被大鼠腸道吸收，而帶有糖苷結(jié)構(gòu)的異槲皮素和蘆丁吸收利用率較低[13]。苦蕎的蘆丁和槲皮素也具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用，且槲皮素為主要的生物效應(yīng)結(jié)構(gòu)單元[14]。但也有研究發(fā)現(xiàn)蘆丁抑制肥胖的效果顯著高于槲皮素[15]。同時(shí)，苦蕎黃酮提取物具有降血糖作用[7,16-21]。從苦蕎食品加工的角度來(lái)看，不同加工技術(shù)促使苦蕎蘆丁不同程度的轉(zhuǎn)化為槲皮素，槲皮素的苦味可令產(chǎn)品口感受到影響，這促使苦蕎脫苦、抑制蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素成為部分企業(yè)傾向于選擇的加工技術(shù)。然而，蘆丁與其前體或降解產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)化，對(duì)苦蕎黃酮功效活性的影響卻沒(méi)有直接報(bào)道，更缺乏關(guān)于細(xì)胞水平上作用機(jī)制的差異報(bào)道。因此，研究蘆丁及其降解產(chǎn)物的降血糖效果不僅有助于進(jìn)一步揭示苦蕎黃酮的降血糖機(jī)制，而且能為苦蕎黃酮生物活性保持的加工技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜，對(duì)苦蕎中的黃酮類化合物進(jìn)行分析定量。同時(shí)基于C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞，從細(xì)胞水平上比較蘆丁、槲皮素、異槲皮素這三類含有不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮對(duì)于葡萄糖攝取的效果，并從分子水平上闡明其作用機(jī)制的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎粉（西蕎2號(hào)） 國(guó)家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系涼山綜合試驗(yàn)站；蘆丁、槲皮素、異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品

中檢所；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）細(xì)胞培養(yǎng)基及雙抗 Hycolne公司；胎牛血清、雙抗 澳洲康寧公司；馬血清 Gibco公司；2-NBDG熒光葡萄糖（2-[N-（7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基）氨基 ]-2-脫氧 D-葡萄糖） 美國(guó) Thermo-fisher公司；胰島素注射液（40 IU/mL, 255 μmol/L） 萬(wàn)邦醫(yī)藥公司；30%丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液（29:1）儲(chǔ)備液、牛血清白蛋白V 北京拜爾迪生物科技有限公司；RIPA（Radio-Immunoprecipitation assay）裂解緩沖液 索萊寶科技公司；一抗（Insulin receptor substract-1（IRS-1）、AKT、phospho-AKT（p-AKT）、AMP-activated protein kinase（AMPK）、 phospho-AMPK （p-AMPK）、acetyl-CoA carboxylase （ACC）、phospho-ACC （p-ACC）、β-actin等），二抗（鼠抗IgG及兔抗IgG） 美國(guó)Cell signal Technology公司；ECL（Enhanced chemiluminescence）發(fā)光液、PVDF（polyvinylidene fluoride）膜 美國(guó)密理博公司；BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒 美國(guó)Bigma公司；小鼠C2C12骨骼肌細(xì)胞（ATCC號(hào)：CRL-1772?） 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；其余藥品 均為分析純。

LC-MS 8050型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、HPLC色譜柱（C18, 2 mm×7.5 mm, 1.6 μm） 日本島津公司；Infinite M200型酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；電泳、Mini protean Tetra Cell轉(zhuǎn)膜裝置、 ChemiDoc XRS+凝膠成像儀 Bio-rad公司；CCL-170B-8型細(xì)胞培養(yǎng)箱、AC2-6SI型超凈工作臺(tái) ESCO公司；3-18K型小型離心機(jī) Sigma公司；IC1000型細(xì)胞計(jì)數(shù)器Count Star公司；DMI-300B型倒置顯微鏡 萊卡公司；細(xì)胞超聲破碎儀器 美國(guó) Sonics公司；BSA224S型分析天平 賽多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎水浸泡處理及黃酮的提取 樣品處理：精密稱取5 g干燥的苦蕎全粉, 先加入蒸餾水30 mL，搖勻，室溫下使苦蕎粉與水充分接觸30 min后，再加入120 mL純甲醇，使得甲醇終體積分?jǐn)?shù)為80%。另外，取干燥苦蕎粉5 g，直接加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液，作為水浸泡處理前的樣品。

黃酮提取方法參考文獻(xiàn)[7]，并做一定修改。在上述條件下，采用80 ℃回流提取2 h，抽濾獲得濾液，濾渣重復(fù)提取1次。合并兩次濾液，50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得苦蕎黃酮提取物。隨后充分溶解并定容于100 mL甲醇，用于黃酮分析實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 苦蕎黃酮分析（HPLC/ESI/MS法） 苦蕎黃酮的分析方法參考文獻(xiàn)[22-23]，并做一定修改。精密稱取一定量蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液配制成一定濃度的對(duì)照液（0～1 mg/mL），以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線（蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9378.1x+1417.3，R2=0.9951；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=38465x+1401.8，R2=0.9965）。總黃酮含量為蘆丁和槲皮素總量。所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，取濾液進(jìn)樣。HPLC條件：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈。流速 0.25 mL/min，進(jìn)樣量為 0.4 μL。流動(dòng)相梯度：0～5 min，10% 乙腈；5～25 min，20% 乙腈；25～40 min，30%乙腈；40～50 min，50%乙腈。PDA檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。質(zhì)譜條件如下：采用負(fù)離子全掃描；粒子源：ESI；霧化氣流：2 L/min；界面溫度：300 ℃；DL 溫度：250 ℃；曲線脫溶劑單元：400 ℃。

1.2.3 C2C12細(xì)胞培養(yǎng) C2C12細(xì)胞培養(yǎng)采用的完全培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（高糖）+10%胎牛血清+1%雙抗，分化培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（高糖）+2%馬血清+1%雙抗，無(wú)血清培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（低糖）+1%雙抗。將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d更換一次完全培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)70%進(jìn)行傳代或播種。

1.2.4 C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn) 葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[24]，并做一定修改。將C2C12細(xì)胞播種至96孔細(xì)胞板（8000個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24 h后更換分化培養(yǎng)基，每隔1 d更換分化培養(yǎng)基，分化5 d后，80%～90%細(xì)胞呈現(xiàn)肌管形態(tài)后，采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后進(jìn)行葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)。

將蘆丁、槲皮素及異槲皮素充分溶于10 μL的DMSO，隨后用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。陽(yáng)性對(duì)照采用胰島素，將胰島素注射液采用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至100 nmol/L。吸棄舊培養(yǎng)基后，加入100 μL不同濃度待測(cè)樣品，陽(yáng)性對(duì)照加入胰島素，反應(yīng)30 min。對(duì)照及空白則加入無(wú)血清培養(yǎng)基。在相同培養(yǎng)時(shí)間（1 h）下，選取不同加樣濃度（10、25、50、100、200、400 μmol/L），探究不同濃度的樣品對(duì)糖吸收的影響；在相同的樣品濃度（50 μmol/L）下，選取不同培養(yǎng)時(shí)間梯度（0.5、1、3 h），探究不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)糖吸收的影響；將終濃度為100 μmol/L的蘆丁、槲皮素及異槲皮素樣品與終濃度為100 nmol/L的胰島素共同反應(yīng)30 min，探究樣品與胰島素的協(xié)同效應(yīng)。葡萄糖攝取采用2-NBDG法測(cè)定。樣品培養(yǎng)反應(yīng)結(jié)束后，用37 ℃預(yù)熱的KRPH緩沖液（pH7.4，118 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L KH2PO4, 1.3 mmol/L CaCl2,1.2 mmol/L MgSO4，30 mmol/L HEPES）清洗細(xì)胞1次后，加入50 μL溶于KRPH緩沖液的2-NBDG（100 μmol/L），空白孔加入KRPH緩沖液，隨后培養(yǎng)板避光放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min后。用4 ℃預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，最后加入150 μL PBS。由熒光分光光度計(jì)測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm）熒光強(qiáng)度。2-NBDG攝取率根據(jù)以下公式計(jì)算：

1.2.5 蛋白印跡法測(cè)定C2C12細(xì)胞蛋白表達(dá) 測(cè)定蛋白相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)量和磷酸化水平參考文獻(xiàn)[24]。將C2C12細(xì)胞播種于6孔細(xì)胞板培養(yǎng)，采用方法1.2.4進(jìn)行分化。待細(xì)胞充分分化后，無(wú)血清培養(yǎng)12 h，將細(xì)胞與100及400 μmol/L的蘆丁、槲皮素、異槲皮素樣品反應(yīng)1 h。陽(yáng)性對(duì)照采用1 μmol/L胰島素作用30 min。隨后，細(xì)胞用PBS清洗2次后，加預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液，并超聲3 s充分裂解細(xì)胞。以14000 ×g的轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液，即為總細(xì)胞裂解液。按比例加入上樣緩沖液，混勻后于95 ℃加熱5 min。取20 μg蛋白/道上樣并電泳（濃縮膠 80 V，0.5 h；分離膠 120 V，1.5 h）。電泳結(jié)束，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜（100 V，1.5 h），與5%BSA封閉1 h。封閉完畢后，加入溶于5% BSA溶液的一抗（一抗稀釋比例為1:2000），4 ℃輕搖過(guò)夜。PVDF膜用TBST洗3次，每次5 min。加入溶于5% BSA的二抗（二抗稀釋比例為1:5000），室溫孵育1 h。PVDF膜用TBST洗3次。將ECL試劑盒的AB液體混合，與二抗孵育后的PVDF膜輕搖反應(yīng)30 s，將PVDF膜平鋪于凝膠成像儀中曝光。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.D.）表示。多組之間的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），事后比較采用Duncan分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎黃酮組成分析及水浸泡處理對(duì)黃酮的影響

苦蕎（西蕎2號(hào)）黃酮的色譜分析如圖2A所示。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)及質(zhì)譜信息，一共鑒定出4種黃酮，分別是槲皮素-蕓香葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-蕓香糖苷及槲皮素。其中，蘆丁和槲皮素的質(zhì)譜圖如圖2B和圖2C所示，它們的[M-H]-（m/z）分別為609及301。苦蕎中鑒定出的黃酮種類與Jiang和Li的研究結(jié)果一致[22-23]。

如圖2A及2D所示，苦蕎中的蘆丁含量為3.09%，占總黃酮的94.81%；槲皮素含量為0.26%，占總黃酮的0.84%，因而蘆丁為苦蕎黃酮的核心組成部分，與Li和Liu的報(bào)道一致[3-4]。但經(jīng)水浸泡處理后，苦蕎粉中的蘆丁幾乎全部降解為槲皮素。槲皮素含量為1.58%，而蘆丁含量可忽略不計(jì)（圖2D）。槲皮素分子量約為蘆丁的一半，因此總黃酮含量下降近一半，本結(jié)果與先前的報(bào)道一致[24-25]。

圖2 苦蕎中黃酮組成的分析Fig.2 Analysis of flavonoids extracted from tartary buckwheat

2.2 不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮對(duì)C2C12細(xì)胞糖攝取的影響

不同濃度的黃酮對(duì)于C2C12細(xì)胞2-NBDG吸收的影響如圖3所示。槲皮素在濃度≥50 μmol/L具有明顯促進(jìn)2-NBDG攝取的作用，而蘆丁和異槲皮素在濃度≥100 μmol/L具有明顯促進(jìn)糖攝取的作用。濃度≥100 μmol/L下，槲皮素促進(jìn)2-NBDG攝取的效果顯著大于蘆丁和異槲皮素（P＜0.05）。在濃度100～200 μmol/L條件下，蘆丁和異槲皮素的促進(jìn)糖攝取作用無(wú)顯著差別（P＞0.05）。當(dāng)濃度為400 μmol/L，異槲皮素的促進(jìn)作用顯著大于蘆丁（P＜0.05）。

圖3 不同濃度的黃酮對(duì)于C2C12細(xì)胞2-NBDG吸收的影響Fig.3 Concentration-dependent effects of flavonoids on 2-NBDG uptake in C2C12 myotubes

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)C2C12細(xì)胞的2-NBDG攝取的影響如圖4所示。在低濃度50 μmol/L下，槲皮素反應(yīng)0.5 h則可顯著促進(jìn)2-NBDG的攝取（P＜0.05），且隨反應(yīng)時(shí)間增加可增加2-NBDG的攝取。相比之下，蘆丁和異槲皮素的反應(yīng)時(shí)間達(dá)3 h才可顯著促進(jìn)2-NBDG 的攝取（P＜0.05）。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間的黃酮對(duì)C2C12細(xì)胞的2-NBDG攝取的影響Fig.4 Time-dependent effects of flavonoids on 2-NBDG uptake in C2C12 myotubes

黃酮與胰島素協(xié)同效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中（如圖5所示），100 μmol/L的蘆丁和異槲皮素促進(jìn)2-NBDG攝取與胰島素持平，而槲皮素顯著高于胰島素刺激后葡萄糖攝取水平（P＜0.05）。這說(shuō)明槲皮素促進(jìn)C2C12細(xì)胞攝取葡萄糖可能存在著非胰島素依賴型的信號(hào)通路。由上述結(jié)果可獲得，苦蕎黃酮對(duì)于C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取作用大小順序如下：槲皮素＞異槲皮素＞蘆丁。

2.3 不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮對(duì)C2C12細(xì)胞信號(hào)通路的影響

如圖6及圖7，通過(guò)蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)蘆丁、異槲皮素對(duì)于胰島素依賴性的信號(hào)通路（IRS-1及AKT磷酸化）無(wú)增效作用，而槲皮素會(huì)抑制IRS-1及AKT 的磷酸化。低濃度（100 μmol/L）及高濃度（400 μmol/L）的槲皮素可明顯促進(jìn)AMPK及下游ACC的磷酸化，且高于蘆丁和異槲皮素。低濃度（100 μmol/L）的蘆丁和異槲皮素沒(méi)有促進(jìn)AMPK磷酸化，但高濃度（400 μmol/L）的蘆丁、異槲皮素均可促進(jìn)AMPK/ACC磷酸化，且異槲皮素的作用大于蘆丁。

圖6 黃酮對(duì)于C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞的蛋白表達(dá)的影響（代表性條帶）Fig.6 Effect of flavonoids on signal pathway of C2C12 myotubes

圖7 小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞蛋白表達(dá)量Fig.7 Relative protein expression of C2C12 myotubes

3 討論與結(jié)論

苦蕎黃酮中核心組成部分為蘆丁，但不同加工順序直接影響苦蕎中黃酮的組成。先與水接觸會(huì)引起苦蕎中黃酮從蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素，并且總黃酮含量下降近一半。而苦蕎中核心黃酮成分的變化對(duì)于其在細(xì)胞水平上的降血糖作用也有一定影響。蘆丁和異槲皮素在低濃度下無(wú)明顯促進(jìn)葡萄糖攝取作用，隨著反應(yīng)時(shí)間增加至3 h，它們也開(kāi)始具有促進(jìn)葡萄糖攝取的作用。有研究表明，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至24 h，低濃度（1 μmol/L）蘆丁可顯著促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取作用[26-27]。結(jié)合本研究說(shuō)明，由于糖苷結(jié)構(gòu)替代槲皮素中的C3-OH基團(tuán)，導(dǎo)致了異槲皮素及蘆丁空間結(jié)構(gòu)增大，空間結(jié)構(gòu)增大可能降低其黃酮的糖攝取活性。另外，在低濃度下，蘆丁和異槲皮素在促進(jìn)葡萄糖攝取上無(wú)顯著性差異，并且不超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照胰島素（P＞0.05）。這說(shuō)意味著空間效應(yīng)比替代C3-OH的引起的葡萄糖攝取變化作用小。但而隨著濃度增加至400 μmol/L，異槲皮素促進(jìn)葡萄糖攝取作用顯著高于蘆丁（P＜0.05），說(shuō)明了異槲皮素和蘆丁空間結(jié)構(gòu)上的差異在高濃度下可能引起糖攝取作用的差異。結(jié)果表明，槲皮素促進(jìn)骨骼吸收葡萄糖效果最佳。同時(shí)，已有報(bào)道稱槲皮素在抑制碳水化合物消化酶效果顯著[10-12]。因此，在能夠接受槲皮素帶來(lái)的苦蕎食品的苦味的情況下，食用富含槲皮素的苦蕎食品更有利于對(duì)血糖的有益調(diào)控。值得注意的是，近年來(lái)為了迎合消費(fèi)者口感的需求，市場(chǎng)上的出現(xiàn)了阻止蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素的苦蕎加工技術(shù)，生產(chǎn)的苦蕎食品中蘆丁含量高且口感不苦，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，那么這些富含蘆丁的苦蕎食品，雖然沒(méi)有槲皮素效果好，但也仍然具有一定的調(diào)控血糖的作用。

糖苷結(jié)構(gòu)的增加會(huì)引起信號(hào)通路的變化及信號(hào)通路強(qiáng)度的變化。蘆丁和異槲皮素（100及400 μmol/L）不能激活胰島素依賴型信號(hào)通路中的IRS-1及AKT磷酸化表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁不能促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞的InsR及AKT的磷酸化[24]。蘆丁可能是通過(guò)胰島素依賴型信號(hào)通路的另外一條PKC信號(hào)通路促進(jìn)葡萄糖攝取作用[28]。因此，蘆丁和異槲皮素在低濃度下（100 μmol/L）對(duì)于糖攝取的促進(jìn)作用可能是通過(guò)胰島素依賴型的其他信號(hào)通路，而非AKT通路。在高濃度下（400 μmol/L），蘆丁和異槲皮素通過(guò)非胰島素依賴型信號(hào)通路中的AMPK/ACC磷酸化促進(jìn)骨骼肌的葡萄糖攝取，并且異槲皮素促進(jìn)AMPK/ACC磷酸化的效果顯著大于蘆丁。研究結(jié)果與先前報(bào)道一致，低濃度（100 μmol/L）的蘆丁不能促進(jìn)AMPK的磷酸化[24]。異槲皮素能夠促進(jìn)AMPK的磷酸化，與文獻(xiàn)相符[29]。結(jié)合本研究結(jié)果說(shuō)明，糖苷結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)的增加可能會(huì)下調(diào)AMPK/ACC磷酸化表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)于葡萄糖攝取率的下降。槲皮素雖然抑制了胰島素依賴型信號(hào)通路IRS-1及AKT磷酸化的表達(dá)，但是，在此條件下，槲皮素依舊能通過(guò)AMPK/ACC磷酸化顯著促進(jìn)骨骼肌的葡萄糖攝取，并顯著高于蘆丁、異槲皮素及胰島素的促進(jìn)作用（P＜0.05）。也有研究表明槲皮素不通過(guò)胰島素依賴型的信號(hào)通路，而是通過(guò)AMPK信號(hào)通路并引起線粒體中的能量代謝變化[30]。

綜上所述，蘆丁、異槲皮素及槲皮素均促進(jìn)C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取作用，但是糖苷鍵的增加會(huì)降低槲皮素糖攝取的效果，作用順序如下：槲皮素＞異槲皮素＞蘆丁。糖苷鍵的增加下調(diào)非胰島素依賴型信號(hào)通路的表達(dá)，從而降低糖攝取。帶有糖苷鍵結(jié)構(gòu)的蘆丁和異槲皮素對(duì)于胰島素依賴型信號(hào)通路中的AKT通路無(wú)明顯促進(jìn)作用，無(wú)糖苷結(jié)構(gòu)的槲皮素反而抑制胰島素依賴型信號(hào)通路。本研究揭示了不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮在細(xì)胞水平上促進(jìn)葡萄糖攝取的構(gòu)效關(guān)系的區(qū)別，對(duì)于充分理解苦蕎黃酮降血糖機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)，有助于根據(jù)消費(fèi)者實(shí)際情況選擇合適的苦蕎加工技術(shù)。