HPLC-CAD法測定不同產(chǎn)地和花期鬧羊花中鬧羊花毒素II、III、V

馮靖雯，郭小紅，李 丹，胡 媛，劉友平，陳鴻平

HPLC-CAD法測定不同產(chǎn)地和花期鬧羊花中鬧羊花毒素II、III、V

馮靖雯，郭小紅，李 丹，胡 媛，劉友平，陳鴻平*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），四川 成都 611137

建立鬧羊花中鬧羊花毒素II、III、V的定量分析方法，并測定不同產(chǎn)地、花期鬧羊花毒素含量，用于鬧羊花藥材的質(zhì)量評價(jià)及產(chǎn)地、采收期的選擇。采用Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇（A）-水（B）流動相，建立高效液相色譜聯(lián)合電霧式檢測器（HPLC-CAD）方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，對17批不同產(chǎn)地、5批不同花期藥材中3種鬧羊花毒素進(jìn)行含量測定，并聚類分析。所建立的分析方法簡便，準(zhǔn)確度和精密度良好，能作為鬧羊花藥材常規(guī)定量評價(jià)方法；不同產(chǎn)地鬧羊花藥材可聚為3類，第1類（湖南永州、郴州、岳陽，湖北黃石及山東日照）鬧羊花毒素V含量明顯低于其他地區(qū)，第2類（江西上饒、撫州與2批購自湖北荷花池中藥材市場，1批湖北隨州）3種鬧羊花毒素總含量低于其他2類，第3類（湖北隨州和安徽岳西、霍山）3種成分含量均較高。不同花期鬧羊花中鬧羊花毒素II、III盛開末期達(dá)最高，鬧羊花毒素V以半開期最高，3種鬧羊花毒素總含量在花蕾期最低，盛開末期最高。鬧羊花毒素II、III、V含量與產(chǎn)地、花期有相關(guān)性，可為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)和為產(chǎn)地、采收期的選擇提供參考依據(jù)。

鬧羊花；HPLC-CAD；質(zhì)量評價(jià)；鬧羊花毒素II；鬧羊花毒素III；鬧羊花毒素V

鬧羊花為杜鵑花科杜鵑屬植物羊躑躅G. Don.的干燥花，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有大毒，列為下品[1]，具有散瘀定痛、祛風(fēng)除濕等作用，可用于治療偏正頭痛、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、頑癬等[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鬧羊花有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、殺蟲等多種藥理作用，同時(shí)表現(xiàn)出對神經(jīng)系統(tǒng)、臟器系統(tǒng)的強(qiáng)烈毒性[3-6]。

鬧羊花藥材的質(zhì)量控制方法研究較薄弱，是歷版《中國藥典》中唯一一味無具體含量測定方法的“大毒”類中藥[2]，其臨床治療劑量與中毒劑量相近，有患者服用臨床用量中毒[7]。鬧羊花中主要含有二萜類、黃酮類、三萜類、木脂素類等成分。據(jù)報(bào)道二萜類成分是其毒效物質(zhì)[8-10]，鬧羊花毒素II、III、V是二萜類代表性成分，故可以作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

由于二萜類成分無紫外吸收，已有采用HPLC-ELSD法建立鬧羊花毒素II、III、VI的含量測定方法[11-12]。但ELSD檢測器基線噪音較大、靈敏度低、線性范圍較窄。電噴霧檢測器（CAD）是近年來發(fā)展起來的一種新型檢測器，目前有采用CAD對中藥中萜類成分檢測，劉麗娜等[13]比較了CAD、ELSD和RID 3種不同檢測器檢測萜類內(nèi)酯含量，結(jié)果證明 CAD 檢測器具有更高的靈敏度。因此，本研究采用HPLC-CAD建立同時(shí)測定鬧羊花毒素II、III、V含量的方法，首次比較不同產(chǎn)地、不同采收期含量差異，進(jìn)一步提升鬧羊花現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為鬧羊花產(chǎn)地、采收期的選擇提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000液相色譜儀、Coron Veo RS電霧式檢測器（賽默飛世爾科技有限公司）；BN3000 型萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；CP2000型十萬分子一電子天平（德國Sartorius公司）；HX-200k型高速粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；UPTUO-I-1000 TE優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都純水科技有限公司）；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SG8200 HDT型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；Waters C18色譜柱（Sysmmetry shield TM RP18，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，美國TEDIA有限公司），甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠），實(shí)驗(yàn)用水為超純水；鬧羊花毒素III對照品（批號11984-201901）、鬧羊花毒素II對照品（批號11983-201901）由中國食品藥品檢定研究院提供；鬧羊花毒素V對照品（批號DS7190922）購自德思特生物，經(jīng)HPLC-DAD（面積歸一化法）檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.0%。

1.3 樣品

收集不同產(chǎn)地樣品17批（表1）、同一產(chǎn)地（S1）不同花期樣品5批（表2和圖1）。所有樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系嚴(yán)鑄云教授鑒定為杜鵑花科杜鵑屬植物羊躑躅G. Don. 的干燥花。

表1 不同產(chǎn)地鬧羊花樣品信息

表2 不同采收期鬧羊花樣品信息

圖1 不同花期鬧羊花

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品儲備液的制備

分別精密稱取鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為860.09、670.06、310.03 μg/mL的對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取鬧羊花粉末（過4號篩）2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，浸泡20 min，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足失重，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇（A）-水（B）梯度洗脫（0～10 min，20%～30% A；10～30 min，30 %～40% A；30～50 min，40%～50% A）。體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；電噴霧檢測器以氮?dú)鉃檩d氣，霧化溫度35 ℃，PF1.0，采集頻率10 Hz，過濾常數(shù)3.6。本實(shí)驗(yàn)條件下所測的3種成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5與其他組分分離完全，拖尾因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)大于6 000，色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合含量測定要求。對照品溶液、供試品溶液及空白溶液的色譜圖見圖2。

1-鬧羊花毒素III 2-鬧羊花毒素V 3-鬧羊花毒素II

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 mL分別置5 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得；分別精密吸取上述混合對照品溶液各20 μL按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定，以進(jìn)樣濃度（）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3，均大于0.999 5，呈良好線性關(guān)系。

表3 鬧羊花中3種成分線性關(guān)系

2.5 定量下限和檢測下限

取“2.4”項(xiàng)下鬧羊花對照品溶液，不斷稀釋，以信噪比/＝3為基準(zhǔn)，測得檢測限，以信噪比/＝10為基準(zhǔn)，測得定量限，結(jié)果見表3。

2.6 精密度考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)測定6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果鬧羊花毒素II、III、V的RSD分別為1.39%、0.62%、1.73%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

精密稱取鬧羊花粉末（S1），按照“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。依照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、2、4、12、24、36 h進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果鬧羊花毒素II、III、V的RSD分別為1.80%、1.43%、1.9%。

2.8 重復(fù)性考察

取樣品粉末編號（S1）6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，得各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD。結(jié)果鬧羊花毒素II、III、V、的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.141%、0.117%、0.243%，RSD分別為2.34%、1.17%、1.64%。

2.9 加樣回收率考察

精密稱取已測定的鬧羊花（S1）樣品粉末1.0 g，平行6份，分別加入3種成分對照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各峰面積，計(jì)算回收率，鬧羊花毒素II、III、V加樣回收率分別為99.50%、103.60%、103.30%，RSD分別為1.40%、1.18%、2.42%。

2.10 耐用性試驗(yàn)

分別考察流動相有機(jī)相甲醇濃度值變化±5%、柱溫變化±5 ℃、體積流量變化±0.05 mL/min、不同的色譜柱（Agilent C18250 mm×4.6 mm，5 μm；Waters C18250 mm×4.6 mm，5 μm；Thermo hypersil gold C18250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行測定時(shí)，儀器色譜行為的變化。檢測同一批鬧羊花3種成分的量及其RSD。結(jié)果各條件下所測各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD均＜3%，表明本方法具有較好的耐用性。

2.11 樣品測定

2.11.1 不同產(chǎn)地樣品測定 精密稱取17批不同產(chǎn)地鬧羊花樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，以外標(biāo)法測定供試品溶液，計(jì)算樣品含量，測定結(jié)果均在線性范圍內(nèi)（除S16）結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地鬧羊花中3種成分的含量測定結(jié)果(n＝3)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品中鬧羊花毒素II、III、V含量有明顯差異，尤以鬧羊花毒素V質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異最大，為0.017%～0.160%，相差9倍，其中湖南永州含量低于檢測限；鬧羊花毒素III質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.106%～0.296%，相差近3倍；鬧羊花毒素II為0.192%～0.395%，相差近2倍。

2.11.2 不同花期樣品測定 精密稱取5批不同花期鬧羊花樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，以外標(biāo)法測定供試品溶液，計(jì)算樣品含量，測定結(jié)果均在線性范圍內(nèi)，結(jié)果見圖3。

圖3 不同花期鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V3種二萜類含量變化(n＝3)

結(jié)果表明不同花期鬧羊花所含化學(xué)成分種類一致，但成分含量存在一定差異性。不同花期鬧羊花中鬧羊花毒素II、III、V的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.184%～0.346%、0.097%～0.156%、0.150%～0.190%。鬧羊花毒素II、III、3種鬧羊花毒素總和含量盛開末期最高，鬧羊花毒素V含量半開期最高。

2.12 聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對17批不同產(chǎn)地的鬧羊花藥材中共有組分進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（除S16外），當(dāng)歐式距離為20時(shí)，全部樣品被分成3大類，第1類[山東（由南方地區(qū)移栽）、湖南岳陽、郴州、永州與相鄰的湖北黃石]鬧羊花毒素V含量明顯低于其他地區(qū)，第2類（江西上饒、撫州與2批購自荷花池，1批湖北隨州）二萜類總含量低于其它2類；第3類（湖北隨州和安徽岳西、霍山）所產(chǎn)鬧羊花中3種成分含量較高。

圖4 鬧羊花樣品的聚類分析

3 討論

3.1 色譜條件與提取方法考察

本實(shí)驗(yàn)對鬧羊花藥材的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，以3個(gè)二萜類成分總含量為優(yōu)化指標(biāo)，分別對物料比（1∶10、1∶20、1∶30）、不同提取溶劑（100%、50%、80%甲醇、水、95%、70%乙醇）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明物料比為1∶10、超聲時(shí)間1 h、80%甲醇作為提取溶劑的條件下，鬧羊花藥材中3種鬧羊花毒素提取率最高。發(fā)現(xiàn)CAD的參數(shù)對測定的準(zhǔn)確性有重要影響，因此本實(shí)驗(yàn)分別考察霧化溫度（35、50 ℃）、功能參數(shù)（1.0、1.3、1.5）、采集頻率（1、5、10、20）、過濾常數(shù)（3.6、5.0）。電噴霧檢測器霧化溫度35 ℃，功能參數(shù)1.0，采集頻率10 Hz，過濾常數(shù)3.6，所得到的圖譜基線平直，靈敏度高，分離度好。

3.2 不同產(chǎn)地對二萜含量的影響

鬧羊花為我國特有植物，主產(chǎn)于南方山區(qū), 因具觀賞性，也作園藝、花藝，部分北方地區(qū)也開始引種栽培。因此，對不同產(chǎn)地鬧羊花中鬧羊花毒素成分含量進(jìn)行研究具有重大意義。結(jié)果表明不同產(chǎn)地鬧羊花藥材中鬧羊花毒素II、III的含量較為穩(wěn)定,鬧羊花毒素V含量差異顯著，其中安徽岳西含量是湖南郴州的9倍。采用SPSS 23.0軟件以不同產(chǎn)地的鬧羊花藥材中3種鬧羊花毒素的含量為特征將樣品聚成3類，山東（由南方地區(qū)移栽）、湖南岳陽、郴州、永州與相鄰的湖北黃石為第1類；江西上饒、撫州與2批購自荷花池，1批湖北隨州為第2類；大別山地區(qū)的湖北隨州，安徽岳西、霍山與河南南陽為第3類，表明地理位置相近的樣本被歸類一起。因此，鬧羊花中3種鬧羊花毒素成分含量受不同地理環(huán)境的影響?！吨袊幍洹?020年版[2]規(guī)定鬧羊花的臨床用量為0.6～1.5 g，安全劑量較窄。有臨床研究報(bào)道，即使在臨床用量范圍內(nèi)（日用量1.0 g）[7]，患者也發(fā)生中毒，這可能跟不同產(chǎn)地鬧羊花毒素含量差異有關(guān)。

3.3 不同采收期對二萜含量的影響

《中國藥典》[2]規(guī)定鬧羊花以花初開時(shí)采收，但對于“初開”界定不明。目前，市售鬧羊花藥材性狀有半開期、盛開期、盛開末期等多種花期。因此，對不同采收期鬧羊花中鬧羊花毒素成分含量進(jìn)行研究具有重大意義，可為花期的選擇提供參考。本實(shí)驗(yàn)于湖北隨州代采從3月底花蕾期至4月下旬盛開末期共5批次鬧羊花，覆蓋了鬧羊花的所有花期。不同花期鬧羊花毒素II、III的變化趨勢相同，花蕾期～半開期含量先升后降，半開期～盛開末期含量呈上升趨勢，以盛開末期含量最高；鬧羊花毒素V五個(gè)時(shí)期先升后降，又升再降，以半開期含量最低；3種鬧羊花毒素含量總和花蕾期最低，盛開末期最高，相差約1.5倍。從含量成分角度，鬧羊花采收應(yīng)以盛花末期為宜，有別于《中國藥典》[2]規(guī)定的“初開”時(shí)采收。中藥質(zhì)量不能唯成分論，3種鬧羊花毒素成分的含量高低，不代表整體化學(xué)信息。因此，本課題組已展開“物質(zhì)基礎(chǔ)-毒性-藥效”多元評價(jià)模式研究鬧樣花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，從多角度交叉分析評價(jià)不產(chǎn)產(chǎn)地、不同花期對鬧羊花質(zhì)量的影響。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Simultaneous determination of rhodojaponins II, III, V offrom different producing area and flowering phase by HPLC-CAD

FENG Jing-wen,GUO Xiao-hong,LI Dan,HU Yuan, LIU You-ping,CHEN Hong-ping

College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Standardization of Traditional Chinese Medicine Ministry of Education State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Resources with Southwest Characteristics, Chengdu, 611137, China

This study was established to simultaneously determine the content of rhodojaponins II, III, and V of, and to compare samples from different origins and flowering stages.Using Waters C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column, methanol (A)-water (B) to establish a high performance liquid chromatography combined with electrospray detector (HPLC-CAD) method, and methodological verification was carried out to determine the content of three kinds of rhodojaponin in 17 batches of different origin and five batches of medicinal materials at different flowering dates, and cluster analysis.The established analytical method was simple, with good accuracy and precision, and can be used as a routine quantitative evaluation method formedicinal materials; Samples from different origins can be grouped into three categories, category 1 (Yongzhou, Chenzhou, Yueyang in Hunan, Huangshi in Hubei and Rizhao in Shandong) rhodojaponin V was significantly lower than that in other regions. The total content of rhodojaponin in category 2 (Jiangxi Shangrao, Fuzhou and two batches purchased from Hehuachi, one batch in Suizhou, Hubei) was lower than that of the other two categories. The content of the three components in the three categories (Suizhou, Hubei, Yuexi, Huoshan, Anhui) was relatively high. Rhodojaponin II and III were the highest in the late blooming period, rhodojaponin V was the highest in the half-open period, and the total content of the three rhodojaponin is the lowest in the flower bud period and the highest in the late blooming period.The content of rhodojaponin II, III, and V is related to the origin and flowering period, which can provide a basis for improving the quality standards of medicinal materials and a reference for the choice of origin and harvesting period.

; HPLC-CAD; Quality evaluation; rhodojaponin II; rhodojaponin III; rhodojaponin V

R286.2

A

0253 - 2670(2021)24 - 7624 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.025

2021-07-09

國重·雙一流·中藥質(zhì)量保障提升創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)（030041011）；重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（cstc2019jcyj-msxmX0552）；重慶市科研院所績效激勵引導(dǎo)專項(xiàng)（cstc2018jxjl130011）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（YYZX20180023）

馮靖雯（1996—），在讀碩士研究生，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。Tel: 15680506886 E-mail: 517244131@qq.com

陳鴻平（1980—），成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教授，博士學(xué)位，主要從事中藥炮制、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。Tel: 13982283303 E-mail: chenhong-ping@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]