基于網絡藥理學研究復健片治療缺血性腦卒中的作用機制

朱巍明 劉偉 劉源

摘要 目的：借助網絡藥理學平臺技術探究復健片治療缺血性腦卒中（IS）的作用機制。方法：利用中藥系統藥理學與分析平臺（TCMSP）、中醫藥綜合數據庫（TCMID）、Batman-TCM數據庫篩選出復健片中何首烏、桑寄生、決明子、淫羊藿、海馬的活性成分及其靶點;利用Uniprot數據庫對復健片中靶點信息進行校對;運用GeneCards數據庫獲取IS的疾病靶點基因;通過Cytoscape 3.7.2軟件及STRING 11.0數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡并進行生物富集分析。結果：獲取復健片治療IS的共45個活性成分和144個靶點，關鍵靶點涉及IL6、IL1β、TNF、VEGFA、NOS3等;IS相關靶點1 485個;獲得300條GO生物過程和84條相關信號通路，涉及PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、核因子κB信號通路等。結論：復健片是通過多成分、多靶點、多通路相互作用的機制來達到治療IS的目的，通過本研究為復健片面向臨床進一步推廣應用提供理論支持，并為未來研究提供思路。

關鍵詞 中醫藥;復健片;缺血性腦卒中;網絡藥理學;蛋白質;靶點;機制;通路

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Fujian Tablets in the treatment of ischemic stroke（IS） with the help of Internet pharmacology platform technology.Methods：TCMSP，TCMID and Batmann-TCM databases were used to screen the active components and their targets of Polygonum multiflorum，sangjis-heng，Cassia obtusifolia，epimedium and hippocampus in Fujian Tablets;the target information in Fujian T-ablets was proofread by UniProt database; the disease target genes of IS were obtained by GeneCard-s database; Cytoscape 3.7.2 software and STRING 11.0 database were used to construct PPI network and conduct bio-enrichment analysis.Results：A total of 45 active components and 144 targets were obtained，including IL6，IL1 β，TNF，VEGFA，NOS3，etc.; 1485 IS related targets; 300 GO biological processes and 84 related signal pathways were obtained，involving PI3K-AKT signaling pathway，TNF signaling pathway，cGMP-PKG signaling pathway，cAMP signaling pathway，NF-κB signaling pathway，etc.Conclusion：Fujian Tablet through the mechanism of multi-component，multi-target，multi-channel interaction can achieve the purpose of treating IS.This research provides theoretical support for the further clinical application of Fujian tablets，and provides ideas for future experimental research.

Keywords Traditional Chinese medicine; Fujian tablet; Ischemic Stroke; Network Pharmacology; Protein; Target; Mechanism; Pathway

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.010

缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）具有高發病率、高致死率、高致殘率和高復發率的特點，是全球第二大致死類疾病[1]，嚴重影響患者生命質量，帶來巨大的經濟和社會負擔。IS屬于中醫“中風”的范疇，肝腎陰虛是其發病的基礎且貫穿疾病全過程。復健片是全國名中醫王新陸教授多年臨床總結的經驗方，以滋補肝腎為主，彌補了祛風化痰活血藥物辛溫燥烈之不足，臨床療效顯著。前期基礎研究表明，復健片可增加局部腦血流量，改善血腦屏障功能，上調GAP-43的表達，促進神經軸突生長，從而改善大腦中動脈閉塞（ Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）大鼠運動功能[2-3]，但因中藥復方的復雜性，其治療IS的潛在機制尚未完全明確。我們運用網絡藥理學技術預測和分析復健片治療IS的藥效成分和相關靶點，探討其作用機制，為復健片進一步開發利用及基礎研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 復健片化學成分的收集 通過中藥系統藥理學與分析平臺（TCMSP）、中藥分子機制的生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，Batman-TCM）、中醫藥綜合數據庫（TCMID），分別以“桑寄生”“何首烏”“海馬”“決明子”“淫羊藿”為關鍵詞檢索復健片中的化合物成分。以藥物動力學原理為基礎，以口服藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[4]，篩選活性成分。

1.2 復健片靶點篩選及“藥物-化合物-靶點”網絡構建 在TCMSP中檢索并篩選復健片活性成分及其相對應的靶點，借助Uniprot數據庫（Universal Protein）對靶點的基因名稱進行校正[5]。將靶點蛋白導入Cytoscape3.7.2軟件構筑“藥物-化合物-靶點”網絡并進行分析。

1.3 復健片治療缺血性腦卒中的潛在作用靶點預測 在人類基因數據庫（GeneCards）中以“Ischemic Stroke”為關鍵詞進行檢索，對疾病相關的基因進行篩選，將其與1.2項下篩選得到的復方靶點相互映射，獲得IS疾病的潛在靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建與分析 將1.3項下篩選得出復健片可能具有治療IS作用的潛在作用靶點輸入STRING 11.0數據庫，規定種屬為“Homo Sapiens”（人類），得到PPI關系并將數據保存為TSV格式文件。將所得文件導入到Cytoscape3.7.2 軟件中構建PPI網絡并分析篩選核心靶點。

1.5 靶點富集分析 為深入了解上述篩選出的復健片治療IS的潛在作用靶點基因的功能以及在信號通路中的作用，利用ClueGO插件進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，DAVID數據庫（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID）進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，設置P<0.05，將物種定義為“Homo Sapiens”。按照其富集的靶點數目進行排序，選取KEGG通路前20個條目進行可視化。

2 結果

2.1 復健片中活性成分的篩選 通過TCMSP、Batman-TCM、TCMID數據庫得到復健片中化合物共271個，其中18個來自何首烏（Batman-TCM數據庫獲取），130個來自淫羊藿，9個來自海馬（TCMID數據庫中獲取），46個來自桑寄生，68個來自決明子。根據OB≥30%且DL≥0.18的標準，篩選得出復健片的活性化合物共45個，其中5個來自何首烏，23個來自淫羊藿，1個來自海馬，2個來自桑寄生，14個來自決明子。見表1。

2.2 “藥物-化合物-靶點”網絡分析 分析網絡中包含188個節點（其中藥物節點5個，活性化合物節點45個，有6個未涉及網絡構建，以及144個靶點節點）及802條邊。網絡中菱形代表復健片中的藥物，三角形代表復方活性化合物，靶基因用方形表示。在網絡中，每條邊表示節點與節點之間的互作關系。度值表示節點與其他節點的連接數目，運用“Network analyze”插件進行分析。根據活性化合物的等級值和中心度值篩選可知，排名前5位的分別為MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000449-豆甾醇、MOL000006-木犀草素、MOL000471-蘆薈大黃素，可與89、56、44、42、33個靶基因相互作用。在靶點中，取排名前5位的靶點，分別是ESR1、AR、PTGS2、NCOA2、DPP4，分別能與31、30、29、24、24個活性化合物相互作用。見圖1。

2.3 復健片治療缺血性腦卒中核心靶點預測及篩選 運用GeneCards數據庫檢索的靶點共篩選得到1 485個IS的潛在靶點，運用Venny 2.1在線工具繪制復健片活性成分靶點和IS靶點的韋恩圖，得到交集靶點共92個，即為預測復健片治療IS的潛在靶點。見圖2。

2.4 復健片治療缺血性腦卒中的核心靶點預測及分析 將篩選得到的92個潛在靶點輸入STRING 11.0數據庫中，得到PPI網絡。借助Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網絡。見圖3。其中共包含90個節點，971條邊。按照度值高低降序排列，取排名前10位的靶點。見表2。

2.5 富集分析 通過ClueGO插件分析得到409個GO富集條目（P<0.05），其中包括44類細胞組分（Cell Component，CC）、65種細胞功能（Molecular Function，MF）和300個生物過程（Biological Processes，BP）。其中BP方面主要涉及信號轉導、積極調控細胞增殖、對缺氧的反應、凋亡過程的負調控、氧化還原過程、老化、血管生成、化學突觸傳遞、MAPK活性的激活、蛋白水解凋亡等過程。MF方面，在蛋白質結合、蛋白質均二聚活性、酶結合、鋅離子結合、絲氨酸型內肽酶活性、受體結合、序列特異性DNA結合、鈣離子結合、藥物結合等富集較為顯著。見圖4。

通過DAVID數據庫共篩選得到KEGG通路84條（P<0.05），主要涉及神經活性配體-受體相互作用、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、HIF-1信號通路、鞘脂信號通路、多巴胺能突觸、Rap1信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、VEGF信號通路、核因子κB信號通路等。富集基因數排名前20的通路利用氣泡圖進行可視化。見圖5～6。

3 討論

缺血性腦卒中發病原因、病理過程及相關機制復雜多樣，長期以來缺乏有效的治療措施。中藥復方具有多靶點、多成分、多功效等優勢，可針對卒中發生、發展的不同過程發揮療效[6-7]。前期臨床研究發現，復健片可促進下丘腦分泌和釋放多巴胺和去甲腎上腺素，通過神經-內分泌系統改善IS患者神經功能缺損狀態[8]，同時研究發現，復健片可促進皮質脊髓束的重塑，改善患者運動功能[9]。基礎研究證明，復健片可促進MCAO大鼠受損腦組織的局部血流量改善，上調膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達，增強星形膠質細胞活性[10]，同時證明復健片可抑制MCAO大鼠大腦皮質及頸髓Nogo-A的表達，上調GAP-43的表達，誘導神經元軸突再生，促進皮質脊髓束重建[2]。

為了進一步研究復健片治療缺血性腦卒中的藥效基礎及潛在的生物學機制，我們利用網絡藥理學平臺技術，篩選網絡中等級值和中心度值較為顯著的節點，所得節點在網絡中可能起到關鍵作用[4]。因此這種在活性化合物與靶點之間的多重對應關系體現了中藥復方的復雜性，同時各成分與靶點之間相互作用可能是中藥復方發揮整體性治療的體現。通過篩選復健片271個化合物，獲得45個活性成分，篩選藥效靶點，獲得92個疾病與藥物交集靶點，構建PPI網絡，基因靶點富集分析及通路預測等手段，得到4個相關重要成分，分別是槲皮素、山柰酚、豆甾醇、木犀草素。其中槲皮素可與89個靶點蛋白發生作用，可見其是治療缺血性腦卒中關鍵成分。槲皮素具有神經保護、抗氧化、抗炎的作用，廣泛應用于腦及脊髓損傷的動物模型中[11-13]，并得到不錯的療效。易波和戴宜武[14]認為槲皮素可以通過保護神經元及線粒體功能來減輕腦卒中后帶來的繼發性損害。槲皮素神經保護功能已得到廣泛應用，但槲皮素的藥理機制研究仍在深入，其臨床使用價值還在不斷進行探索。而山柰酚同樣也具有抗炎、抗氧化的作用，且可顯著降低缺血再灌注腦組織局部氧自由基水平，減少細胞凋亡，從而保護腦組織[15]。豆甾醇屬植物甾醇的一種，其在抗炎、抗氧化及中樞神經系統保護方面都發揮作用[16];有研究表明，植物甾醇亦在調節血脂，降低膽固醇等方面發揮重要作用[17]。木犀草素具有抗氧化、抗炎及抗過敏活性等作用[18-19]。喬會敏等[20]通過動物實驗證明木犀草素可改善MCAO大鼠神經功能缺失，減輕腦水腫，減小腦梗死的體積。

根據復健片治療缺血性腦卒中的PPI網絡結果分析得出90個靶點，通過分析發現IL6、IL1β、VEGFA、TNF、NOS3等靶點可能是復健片治療缺血性腦卒中的關鍵靶點。白細胞介素-6（IL-6）主要由活化的單核細胞產生，當機體發生炎癥反應時，單核細胞最早活化并產生IL-6，其是多功能性的，具有促進炎癥發生及抗炎的雙重作用，在顱腦損傷及感染等情況發生時，IL-6表達水平上升，加重炎癥反應，而在生理狀態下，IL-6可維持和調節神經細胞的生長[21-22]。白細胞介素-1β（IL-1β）也屬于白細胞介素一種，有研究表明，下調其表達可抑制炎癥反應，改善缺血性再灌注后的腦損傷[23]。腫瘤壞死因子（TNF）亦具有雙向調節，在腦缺血發生后水平顯著上升，從而誘發炎癥反應和細胞凋亡，導致腦水腫、腦梗死等病變，而其也可增加腦組織對缺血的耐受程度[24]，其機制復雜尚待進一步探索。在血管發成與形成過程中，血管內皮生長因子A（VEGFA）發揮著重要作用，楊冀萍和劉新峰[25]認為血管內皮生長因子在腦缺血損害時具有神經保護作用，降低缺血性損傷，促進神經功能的恢復，其應用可促進血管芽生，實現缺血區的再灌注。動物實驗也表明，血管內皮生長因子可誘導缺血動物模型缺血區血管生成，趨化室管膜下區新生神經元向缺血區遷移[26]。此外，一氧化氮合酶（NOS）與腦卒中的研究目前較少，NOS3屬NOS的一種，又稱為內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS），有研究表明，其與腦缺血的發生相關[27]，仍須進一步研究。環氧合酶2（COX2）在MCAO大鼠模型中的表達相比假手術組顯著升高，而且COX2的表達升高，可誘發炎癥反應，參與腦缺血的損傷，而COX2表達的減少有助于MCAO大鼠神經功能的恢復[28-29]。

通過復健片治療缺血性腦卒中的靶點GO富集分析得出，信號轉導、調控細胞增殖、凋亡過程的負調控、氧化還原過程、血管生成、蛋白水解凋亡等生物過程可能發揮主要作用，在復健片抗缺血性腦卒中的治療中這些過程顯得較為重要。KEGG富集通路分析得出，復健片治療缺血性腦卒中的潛在靶點主要涉及神經活性配體-受體相互作用、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、核因子κB信號通路等。進一步分析發現，復健片治療缺血性腦卒的療效是否來源于與腦缺血關聯較為密切的PI3K-AKT信號通路、cGMP-PKG信號通路、核因子κB信號通路，仍須進一步的實驗研究。其中，PI3K-AKT信號通路通過分析發現其應用廣泛，且通路較為復雜。目前研究發現，PI3K-AKT信號通路與腦缺血發生后細胞的凋亡有密切關系，多種神經營養因子、缺血后處理及中藥通過激活PI3K/AKT信號通路抑制細胞凋亡來實現神經的營養及保護作用[30-31]。而核因子κB信號通路的激活與靶點基因IL6及TNF合成與釋放有著直接的聯系。此外，有研究表明，cGMP-PKG信號通路參與調節神經發生及細胞增殖過程并發生重要作用[32]，同時激活cGMP-PKG信號通路可促進神經發生，改善缺血后小鼠的神經結構和功能[33]。

綜上所述，采用網絡藥理學的研究方法證明復健片治療缺血性腦卒中具有多成分、多靶點、多通路的特點，并從多個角度探討復健片治療缺血性腦卒中的潛在作用機制及靶點，并為復健片的臨床應用提供理論支持，同時為復健片的進一步實驗研究提供思路。但本研究仍有一定的局限性，由于數據庫的數據及相關文獻有限，所預測得出復健片治療靶點所展示的相關通路，其機制研究仍需進一步深入研究。

參考文獻

[1]Benjamin EJ，Blaha MJ，Chiuve SE，et al.Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update：A Report From the American Heart Association[J].Circulation，2017，135（10）：e146-e603.

[2]王新陸，王中琳，周永紅.下調腦區的激活及其中藥作用機制的研究[J].中醫藥學刊，2004，22（8）：1365-1367.

[3]劉維，英振昊，張國麗，等.從Nogo-A-NgR信號通路探討MCAO大鼠皮脊髓束重塑的啟動及復健片干預機制[J].中風與神經疾病雜志，2019，36（10）：896-901.

[4][1]劉源，劉金豹，彭偉.人參敗毒散治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）作用機制的網絡藥理學探討[J].中藥材，2020，43（6）：1531-1539.

[5]劉源，許波，劉金豹，等.獨活寄生湯治療膝骨性關節炎分子機制的網絡藥理學探討[J].海南醫學院學報，2020，26（16）：1242-1249.

[6]張艾嘉，王爽，王萍，等.缺血性腦卒中的病理機制研究進展及中醫藥防治[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（5）：227-240.

[7]管欣，張瑤，李洪超.注射用尤瑞克林與丁苯酞氯化鈉注射液治療輕-中度急性缺血性腦卒中的成本效用分析[J].中國新藥雜志，2020，29（6）：715-720.

[8]韓萍，于春蕾，張娜，等.滋補肝腎中藥調控神經-內分泌系統治療腦梗死的臨床研究[J].中醫臨床研究，2016，8（27）：38-40.

[9]李鑫，劉偉，秦玲.復健片促進皮質脊髓束重塑的臨床觀察[J].北京中醫藥大學學報，2017，40（1）：70-76.

[10]劉偉.復健片對MCAO大鼠腦組織GFAP表達及局部腦血流量的影響[J].中華中醫藥學刊，2009，27（1）：49-51.

[11]Schültke E，Kendall E，Kamencic H，et al.Quercetin promotes functional recovery following acute spinal cord injury[J].J Neurotrauma，2003，20（6）：583-591.

[12]Lee JK，Kwak HJ，Piao MS，et al.Quercetin reduces the elevated matrix metalloproteinases-9 level and improves functional outcome after cerebral focal ischemia in rats[J].Acta Neurochir（Wien），2011，153（6）：1321-1329.

[13]Kinaci MK，Erkasap N，Kucuk A，et al.Effects of quercetin on apoptosis，NF-κB and NOS gene expression in renal ischemia/reperfusion injury[J].Exp Ther Med，2012，3（2）：249-254.

[14]易波，戴宜武.槲皮素對腦卒中神經損傷修復的研究進展[J].中華神經創傷外科（連續型電子期刊），2016，2（3）：181-183.

[15]何煜舟，丁美萍，汪云開，等.山萘酚對缺血再灌注腦損傷大鼠的保護作用[J].中華中醫藥學刊，2009，27（8）：1673-1675.

[16]汪帥，孫宇，李春梅，等.豆甾醇的研究進展概述[J].中國藥業，2019，28（23）：96-98.

[17]盧婧霞，鄭祖國，徐志猛，等.植物甾醇降血脂機制研究進展[J].中國中藥雜志，2019，44（21）：4552-4559.

[18]Shimoi K，Masuda S，Furugori M，et al.Radioprotective effect of antioxidative flavonoids in gamma-ray irradiated mice[J].Carcinogenesis，1994，15（11）：2669-2672.

[19]Yamamoto H，Sakakibara J，Nagatsu A，et al.Inhibitors of arachidonate lipoxygenase from defatted perilla seed[J].J Agric Food Chem，1998，46（3）：862-865.

[20]喬會敏，陳林玉，杜媛媛，等.木犀草素對大鼠缺血性腦組織上調Nrf2、Bcl-2下調Bax的表達[J].腦與神經疾病雜志，2017，25（11）：672-676.

[21]Song L，Pei L，Yao S，et al.NLRP3 Inflammasome in Neurological Diseases，from Functions to Therapies[J].Front Cell Neurosci，2017，11：63.

[22]陳笑蘭，王陽，曾其毅.白細胞介素-6及其信號通路在中樞神經系統感染中的作用研究進展[J].中國實用兒科雜志，2019，34（4）：305-308.

[23]劉俊偉，任冶龍，劉旭玲，等.人參皂苷Rb1對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積及腦組織和血清IL-1β的影響[J].中國中西醫結合雜志，2013，33（12）：1696-1700.

[24]何嬋，羅華麗，季暉.基于TNF-α的腦缺血再灌注損傷機制及相關藥物研究進展[J].中國藥房，2016，27（28）：4016-4020.

[25]楊冀萍，劉新峰.血管內皮生長因子治療性血管生成作用與缺血性腦血管病[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（7）：1354-1359.

[26]Wang Y，Jin K，Mao XO，et al.VEGF-overexpressing transgenic mice show enhanced post-ischemic neurogenesis and neuromigration[J].J Neurosci Res，2007，85（4）：740-747.

[27]朱殊，江順福，曹銘華，等.NOS3基因多態性與血脂、缺血性腦卒中的相關性研究[J].中風與神經疾病雜志，2019，36（8）：697-700.

[28]房亞蘭，黃語悠，趙詠梅，等.大黃酚對局灶性腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區環氧化酶2和基質金屬蛋白酶-9表達的影響[J].首都醫科大學學報，2017，38（1）：47-52.

[29]尹潔，閆峰，李森，等.環氧化酶2參與遠隔缺血預適應對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國神經免疫學和神經病學雜志，2014，21（3）：166-169.

[30]許藝超，石松生.PI3K/Akt信號通路在腦缺血神經元凋亡中作用的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2012，39（6）：530-533.

[31]吳丹，高耀，向歡，等.PI3K/Akt信號通路在抑郁癥及抗抑郁中藥作用機制研究中的進展[J].中草藥，2019，50（18）：4461-4469.

[32]lmestig J，Marlet IR，Hainsworth AH，et al.Phosphodiesterase 5 inhibition as a therapeutic target for ischemic stroke：A systematic review of preclinical studies[J].Cell Signal，2017，38：39-48.

[33]校歡，馬曉嬌，承歐梅，等.NO-cGMP-PKG信號通路在天麻素促進腦缺血后海馬神經發生中的作用[J].中國中藥雜志，2019，44（24）：5451-5456.

（2020-08-20收稿 責任編輯：張雄杰）