大麻素1型受體過表達對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經干細胞的影響

潘晶晶 鄒蕾 黃志遠 孫香蕾

摘要 目的：探討大麻素1型受體（CB1R）過表達對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦神經干細胞的影響。方法：建立EAE小鼠模型（n=50）并設置佐劑組（n=10）和對照組（n=10），建模成功的EAE小鼠注射CB1R過表達慢病毒液并記為CBlR過表達組（n=20），設置空載體組（n=10）和EAE模型組（n=20）。評價各組小鼠神經功能，觀察對照組、EAE模型組和CBlR過表達組小鼠的腦組織病理學變化，檢測腦組織CB1R、室管膜下區Brdu和Brdu+/Nestin+以及Sox-2 mRNA水平。結果：EAE模型組神經功能評分升高、CBlR蛋白降低（P<0.05），CBlR過表達組神經功能評分下降、CBlR蛋白升高（P<0.05）。EAE模型組腦組織出現炎癥細胞浸潤及髓鞘缺失等典型病理變化，CBlR過表達組的病理損傷顯著改善。EAE模型組Brdu、Brdu+/Nestin+陽性細胞以及Sox-2mRNA水平均顯著增加（均P<0.05），CBlR過表達組比較EAE模型組亦顯著增加（P<0.05）。結論：過表達CBlR可能是通過加速小鼠腦神經干細胞的增殖從而促進腦組織損傷的修復，最終有效減輕了自身免疫性腦脊髓炎小鼠的癥狀。

關鍵詞 大麻素1型受體;過表達;實驗性自身免疫性腦脊髓炎;小鼠;腦組織室管膜下區;神經干細胞;5-溴-2′-脫氧尿苷;巢蛋白

Abstract Objective：To investigate the effect of cannabinoid 1 receptor（CB1R） overexpression on cerebral nerve stem cells in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods：EAE models（50 mice） were established，as well as an adjuvant group of 10 and a control group of 10 mice.In the models built successfully，EAE mice were injected with CB1R overexpression lentivirus and recorded as CBlR overexpression group（20 mice）.Null vector group（10 mice） and the EAE model group（20 mice） were also set.Neurological functions of mice in each group were evaluated，pathological changes of brain tissue were observed，and levels of CB1R，Brdu and Brdu+/Nestin+ in subependymal area and SOX-2 mRNA of brain tissue were detected.Results：In the EAE model group，neurological function score increased and CBlR protein decreased（P<0.05），while neurological function score decreased and CBlR protein increased in the CBlR overexpression group（P<0.05）.Typical pathological changes，such as inflammatory infiltration and myelin loss，occurred in the EAE model group.Pathological damage was significantly improved in the CBlR overexpression group.The levels of Brdu，Brdu+/Nestin+ positive cells and SOX-2 mRNA in the EAE model group were significantly increased（P<0.05），and so were the other two groups（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of CBlR may promote the repair of brain tissue damage by accelerating the proliferation of brain neural stem cells in mice，and effectively alleviate the symptoms of autoimmune encephalomyelitis in the end.

Keywords Cannabinoid 1 receptor; Overexpression; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Mice; Subependymal area of brain tissue; Neural stem cells;5-bromo-2′-deoxyuridine; Nestin

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.016

作為一種中樞神經系統（Central Nervous System，CNS）疾病，多發性硬化（Multiple Sclerosis，MS）的主要病理特點為髓鞘脫失、炎癥損傷且伴發軸索的丟失。其發病機制目前尚不完全明確，但免疫調節功能異常被認為與該病密切相關[1-3]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE）的病理及免疫特征與多發性硬化相似，因而常被作為最經典的動物模型廣泛用于多發性硬化的基礎研究[4-5]。具有自我更新并長期保持多項分化潛能的神經干細胞（Neural Stem Cells，NSCs）經過一定條件的誘導可增殖分化為星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元細胞[6]。內源性大麻素、大麻素受體（Cannabinoid Receptor，CBR）、調節大麻素合成、轉運及失活的相關蛋白、酶類均為內源性大麻素系統（Endocannabinoid System，ECS）的主要組成部分。ECS被認為可抑制神經興奮性毒性，參與免疫炎癥反應，進而維持中樞神經系統微環境的穩定，最終起到保護神經的作用[7]。大麻素1型受體（CB1R）和大麻素2型受體（CB2R）是大麻素受體的2種類型，均為G蛋白偶聯受體[8]。以往研究證實內源性大麻素系統功能失調發生于多發性硬化中，而CB1R是目前被公認且研究較多的大麻素受體類型。本研究通過構建過表達CB1R的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型，觀察小鼠腦組織神經干細胞標志物5-溴-2′-脫氧尿苷（5-bromo-2′-deoxyuridine，Brdu）、神經上皮前體細胞中的一種中間絲蛋白巢蛋白（Nestin）以及轉錄因子Sox-2的變化，探討CB1R對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠腦神經干細胞的影響及對該病的可能保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取70只6～8周齡健康雌性C57B/L6小鼠，22～25 g/只，采購于斯貝福（北京）生物技術有限公司[動物許可證號：SCXK（京）-2019-0010]，實驗前于20～24 ℃室溫下適應性飼養1周，其間讓小鼠自由飲水進食。

1.1.2 試劑與儀器 MOG35-55肽段（北京聯科生物公司，貨號：FS1061）;完全弗氏佐劑（CFA）（Sigma公司，美國，貨號：F5881）;百日咳毒素（PTX）（Enzo Life Sciences公司，美國，貨號：BML-G100-0050）;過表達CB1R慢病毒及空載體對照由上海吉凱設計并構建;Anti-Cannabinoid Receptor I抗體（兔多克隆抗體to Cannabinoid Receptor I，Abcam公司，美國，貨號：ab23703）;Anti-BrdU抗體[BU1/75（ICR1）]（HRP，Abcam公司，美國，貨號：ab220507）;Anti-Nestin抗體（EPR22023，Abcam公司，美國，貨號：ab221660）;驢抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預吸附二抗（Abcam公司，美國，貨號：ab150153）;山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）預吸附二抗（Abcam公司，美國，貨號：ab150083）;垂直電泳儀、轉膜儀（BioRad公司，美國，型號：1658003）;酶標儀（BioTek公司，美國，型號：synergy2）;光學顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：BX51F32H01）;實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國，型號：7500Fast）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有小鼠分為5組，分別是EAE模型組、佐劑組、對照組、CBlR過表達組和空載體組。取3 mg MOG35-55肽段溶于1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，另取3 mg結核菌素溶于1 mL完全弗氏佐劑中，各取相同體積的2種溶液置于針管中，充分混合使其成油包水乳白色混懸液，靜置無分層即為合格的MOG35-55抗原混懸液。

建模方法：1）EAE模型組（20只）：以每只C57B/L6小鼠200 μL的劑量于其背部脊柱兩側分4點注射，同時以200 ng/只的劑量尾靜脈注射百日咳毒素（PTX），為加強免疫，48 h后腹腔注射相同劑量的百日咳毒素（PTX）。2）佐劑組（10只）：混懸液中用1 mL PBS取代MOG35-55，免疫方法與EAE模型組相同。3）對照組（10只）：僅注射相同體積的生理鹽水。4）CBlR過表達組（20只）：建模成功的EAE小鼠注射CB1R過表達慢病毒液。5）空載體組（10只）：注射相同體積的攜帶空載體的慢病毒液。

1.2.2 干預方法 取建模成功的EAE小鼠30只隨機分為2組，CBlR過表達組（n=20）：發病當天于EAE小鼠L4/5間隙注射過表達CB1R慢病毒液;空載體組（n=10）：發病當天于EAE小鼠L4/5之間注射相同體積的攜帶空載體的慢病毒液。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 神經功能學評分 從免疫當天開始至免疫后第28天對空載體組、佐劑組、對照組、EAE模型組及CBlR過表達組小鼠進行神經功能評分：無癥狀記0分;垂尾記1分;輕微后肢無力、行路不穩及翻正反射遲鈍記2分;后肢麻痹和（或）前肢力弱記3分;前肢麻痹記4分;四肢癱記5分;瀕臨死亡或死亡記6分。

1.2.3.2 Western Blotting檢測CB1R蛋白表達 免疫后第28天將對照組、EAE模型組及CBlR過表達組小鼠處死并取其大腦組織，用動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量。將制備的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，之后轉模至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫下加含5%BSA的封閉液作用2 h，加入用封閉液稀釋的兔抗小鼠CB1R一抗，置于4 ℃冰箱過夜。次日取出復溫，加適量PBST洗膜3次，10 min/次，再加稀釋好的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫震蕩孵育1 h，PBST洗膜，干凈后加ECL顯色，暗室曝光拍照，同時以GAPDH作為內參蛋白。

1.2.3.3 HE染色和WEIL染色觀察組織病理學變化 將對照組、EAE模型組及CBlR過表達組小鼠處死后取其脊髓腰膨大處組織，4%甲醛溶液固定后，依次經石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水等步驟，分別經蘇木精-伊紅（HE）染色和WEIL染色，二甲苯透明后用中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察組織病理學變化以及髓鞘脫失情況。

1.2.3.4 免疫組織化學法檢測腦組織室管膜下區Brdu的表達 處死對照組、EAE模型組及CBlR過表達組小鼠。用生理鹽水將Brdu稀釋成20 mg/mL的溶液，于小鼠被處死前2 d以100 mg/kg的劑量進行腹腔注射，1次/d，連續2 d。第3天腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，沿肋骨內緣切開橫膈以使心臟暴露，經左心室將注射器刺入主動脈，剪開右心耳，灌注生理鹽水至流出液清亮后，再先快后慢灌注4%多聚甲醛至小鼠尾巴、四肢僵直，1 h后將腦組織取出后置于4%的多聚甲醛溶液4 ℃固定48 h，然后用30%蔗糖進行脫水處理48 h，于冰凍切片機連續切片，防凍液中-20 ℃保存備用。經磷酸鹽緩沖液（PBS）靜置水化及沖洗，加封閉液室溫作用1 h，加稀釋好的大鼠抗Brdu單克隆抗體4 ℃過夜，次日，PBST洗滌，再加稀釋好的驢抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預吸附二抗孵育，PBST洗滌，加防熒光衰減劑并封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.5 免疫熒光檢測腦組織室管膜下區Brdu+/Nestin+的表達 取對照組、EAE模型組及CBlR過表達組小鼠腦組織切片，用PBS靜置水化及沖洗，加封閉液室溫作用1 h，加稀釋好的大鼠抗Brdu單克隆抗體4 ℃過夜，次日，PBST洗滌，再加稀釋好的驢抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預吸附二抗孵育，PBST洗滌，依次加4%多聚甲醛常溫避光15 min，2N HCl于37 ℃避光30 min，0.1 mol/L硼酸常溫避光震蕩孵育10 min，PBST洗滌，加稀釋好的Anti-Nestin單克隆抗體4 ℃避光過夜，次日，復溫后PBST洗滌，加山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）預吸附二抗37 ℃孵育2 h，PBST沖洗干凈，滴加防熒光衰減劑并封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.6 RT-qPCR檢測腦組織Sox-2mRNA的水平 將對照組、EAE模型組及CBlR過表達組小鼠脊髓組織投入液氮罐中反復凍存使其破碎，用Trizol提取總RNA并進行反轉錄，以得到的cDNA作為模板進行熒光定量PCR，檢測組織中Sox-2的表達水平。同時以β-actin作為內參基因。每個樣本均進行3次重復實驗。

1.3 統計學方法 GraphPad Prism 5.0軟件用于作圖，采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗，2組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠神經功能學評分 EAE模型組小鼠在免疫后食欲有所減退，體質量逐漸下降，免疫后10 d開始陸續發病，初期尾部張力減弱或消失，之后步態笨拙，行動不便，隨著癥狀加重最終發生雙后肢癱瘓。佐劑組和對照組均未出現任何腦脊髓炎癥狀，各時間點的平均神經功能評分都是0分，且體質量隨著生長不斷增加。空載體組小鼠與EAE模型組小鼠在免疫后10 d、14 d、21 d和28 d的平均神經功能評分分別是0.9、1.4、2.3和2.8分，表現相似，神經功能評分差異無統計學意義（P>0.05）。CBlR過表達組不同時間點的平均神經功能評分分別是0.9、1.3、1.4和1.6分，與EAE模型組比較，CBlR過表達組隨著CBlR表達量的增加，腦脊髓炎癥狀逐漸減輕，神經功能評分顯著下降（P<0.05）。見圖1。

2.2 小鼠腦組織中CB1R蛋白表達 Western Blotting檢測結果顯示，對照組、EAE模型組和CBlR過表達組小鼠腦組織中CBlR/GAPDH分別是0.45、0.18和0.39。EAE模型組明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。CBlR過表達組相較于EAE模型組顯著回升，趨近于對照組（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組小鼠組織病理學變化 HE染色發現，EAE模型組小鼠脊髓腰膨大處組織中出現以淋巴細胞為主的大量炎癥細胞浸潤，且呈典型的“袖套”狀聚集在血管周圍;對照組極少見炎癥細胞浸潤病灶，CBlR過表達組病理變化顯著改善，趨向于正常。見圖3。

WEIL染色結果顯示，EAE模型組小鼠組織中有大小及形狀不一的點狀或成片的白色空泡，即為髓鞘缺失區域，高倍鏡下觀察該區域可見存在炎癥細胞浸潤;對照組小鼠髓鞘整齊而完好，CBlR過表達組亦極少出現髓鞘缺失區域。見圖4。

2.4 各組小鼠腦組織室管膜下區Brdu的表達 小鼠腦組織室管膜下區Brdu陽性細胞核呈不規則形、橢圓形或圓形，成簇或散在分布。對照組、EAE模型組和CBlR過表達組Brdu陽性細胞表達率分別是14%、18%和27%。EAE模型組Brdu陽性細胞數增加比對照組顯著（P<0.05），CBlR過表達組增加比EAE模型組明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5。

2.5 各組小鼠腦組織室管膜下區Brdu+/Nestin+的表達 對照組、EAE模型組和CBlR過表達組小鼠腦組織室管膜下區Brdu+/Nestin+陽性細胞表達率分別是2.3%、9.9%和18.2%。EAE模型組小鼠腦組織室管膜下區Brdu+/Nestin+的表達高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;與EAE模型組比較，CBlR過表達組顯著升高（P<0.05）。見圖6。

2.6 各組小鼠腦組織Sox-2mRNA的水平 對照組、EAE模型組和CBlR過表達組小鼠腦組織中Sox-2/β-actin分別是0.14、0.38和0.61。與對照組比較，EAE模型組小鼠腦組織中Sox-2mRNA水平明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）。與EAE模型組比較，CBlR過表達組亦顯著增加（P<0.05）。見圖7。

3 討論

大麻素1型受體（CB1R）主要分布于中樞神經系統，腦內的CB1R主要存在于大腦皮質、小腦、海馬CA錐體細胞層以及基底神經節的蒼白球、黑質和外側紋狀體。其功能為參與運動與體位控制、認知、情感、記憶、內分泌調節等[9-10]。大麻素受體（CBR）被證實在多種神經系統疾病中發揮免疫調節及神經保護的作用。有研究發現，CBlR在正常小鼠腦內的神經元中表達較多，少量表達于小膠質細胞中，星形膠質細胞不表達。此外，在MS患者的皮質神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞、浸潤的T淋巴細胞及巨噬細胞均有CB1R的表達[11-13]。

本研究結果發現，對照組和佐劑組均未發病，EAE模型小鼠出現腦脊髓炎癥狀，神經功能評分顯著升高，空載體組與EAE模型組癥狀相似，CBlR過表達組小鼠腦脊髓炎癥狀逐漸減輕，神經功能評分顯著下降。該結果表明EAE模型小鼠成功建立，CBlR可減輕EAE的臨床癥狀。EAE模型組小鼠腦組織中CBlR蛋白表達量顯著低于對照組，CBlR過表達組顯著升高，提示EAE能降低CBlR蛋白水平，EAE模型小鼠成功實現CBlR過表達。目前已發現多發性硬化（MS）的主要病理變化為炎癥細胞浸潤、髓鞘脫失以及軸索損傷等。本研究經HE染色發現EAE模型小鼠脊髓腰膨大處組織中大量炎癥細胞浸潤且呈典型的“袖套”狀聚集在血管周圍，CBlR過表達組病理變化改善顯著，趨向于對照組。WEIL染色發現EAE模型小鼠髓鞘缺失且高倍鏡下可見炎癥細胞浸潤，CBlR過表達組極少出現髓鞘缺失區域，大多髓鞘完好而整齊。該結果進一步證實構建的EAE模型小鼠出現典型的病理改變，CBlR則可逆轉EAE對小鼠組織的病理損傷。

作為一種胸腺嘧啶脫核尿苷類似物，Brdu在細胞周期的S期可嵌入到細胞核DNA，常被用作具有增殖活性細胞的標志物，因此新生成的神經干細胞（NSCs）可采用其陽性細胞來表示[14]。DNA進行半保留復制且在S期合成，此時將DNA合成所需要的原料進行標記或者加入原料的類似物，均可進入DNA雙鏈進而標記出新增殖的細胞[15]。以往觀點認為人和其他哺乳動物的中樞神經系統被損傷后很難恢復，而近年來隨著干細胞的發現，NSCs已相繼從嚙齒類動物、人的胎盤及成年腦組織中被分離純化出來[16]。此外，成體哺乳動物中樞神經系統側腦室壁的室管膜下區（SVZ）及海馬齒狀回的顆粒下層（SGZ）被證實為NSCs的2個聚集區[17]。神經上皮前體細胞中的一種中間絲蛋白巢蛋白（Nestin），在整個成年期中樞神經系統的神經發生區域均表達的轉錄因子Sox-2均常被用做NSCs的標志物[18-19]。本研究通過免疫組織化學檢測小鼠腦組織室管膜下區Brdu及Brdu+/Nestin+陽性細胞發現，EAE模型組比對照組顯著增加，CBlR過表達組比較EAE模型組亦顯著增加。RT-qPCR檢測小鼠腦組織Sox-2mRNA表達水平與Brdu一致。分析原因可能跟其作用機制有關，正常生理條件下，NSCs不發生增殖分化而是處于相對靜息狀態，腦組織發生病理損傷可導致微環境的變化，若該刺激達到NSCs分裂增殖的閾值時，NSCs則自我復制產生新細胞，并進行規律性遷移到達特定部位，根據需要分化為相應區域的細胞，進而替代損傷細胞并重建神經功能發揮作用[20]。炎癥介質透過血腦屏障進入EAE小鼠的中樞神經系統，微環境的變化使NSCs被激活，因而EAE小鼠中樞神經系統NSCs開始增殖;CBlR過表達組NSCs增殖水平顯著高于EAE模型組，提示CBlR可能是通過加速小鼠中樞神經系統中NSCs的增殖進而促進腦組織損傷的修復。

綜上所述，過表達CBlR可加速小鼠中樞神經系統中神經干細胞的增殖，從而促進腦組織損傷的修復，最終實現有效減輕自身免疫性腦脊髓炎小鼠的癥狀。

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（2020-04-25收稿 責任編輯：楊覺雄）