高效液相色譜法同時測定巴氏殺菌乳中 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

胡 敏，張彩云，李志君，段國霞

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

巴氏殺菌乳是指在72 ℃條件下經過15～30 s的短時巴氏殺菌處理得到的液體產品[1-2]。GB 19645—2010《食品安全國家標準 巴氏殺菌乳》[3]中明確，巴氏殺菌乳蛋白質含量≥2.9 g/100 g。蛋白質是生命體中最豐富和最重要的大分子之一，在生命活動中起重要作用，是牛乳中最重要的營養物質之一。乳中的蛋白質，根據其在牛乳pH值調節到4.6時溶解度特性的不同可分為兩大類，一類為酪蛋白（約占乳蛋白質含量的80%），一類為乳清蛋白（約占乳蛋白質含量的20%）[4-7]。乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白為主要成分，分別占乳清蛋白總量的12%～19%和48%～50%[8-10]，乳清蛋白對熱不穩定，巴氏殺菌乳可使15.4%的乳清蛋白發生變性[11]。

α-乳白蛋白是唯一能結合鈣的乳清蛋白，屬于小分子蛋白質，是必需氨基酸和支鏈氨基酸的重要來源。α-乳白蛋白富含色氨酸，是神經發育的重要因子，能夠調節睡眠、食欲和情緒[4]。β-乳球蛋白是由162 個氨基酸殘基、2 個二硫基團（S-S）和1 個硫氫基團（-SH）組成的一種分子質量約18.3 kDa的球狀蛋白，至少有9 種變體（A、B、C、D、E、H、I、J和W），已知最常見的是A、B變體[12-13]。β-乳球蛋白與葉酸結合，可以有效增強其穩定性；與脂溶性維生素和脂肪酸等結合，可以改善牛乳的風味、促進營養物質的吸收，也可以延緩某些脂肪酸和維生素的氧化降解，起到保護作用[14]。

隨著經濟的發展和人們生活水平的提高，消費者對牛乳中營養物質的需求日漸增強。對牛乳蛋白的研究集中于對健康具有促進作用的蛋白質及酪蛋白降解后形成的生物性肽[15]。巴氏殺菌乳因其較高的營養價值[16]， 最大限度保留生乳的純正口味，被消費者青睞[17]。但目前檢測巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白尚無國標方法。本研究采用最為常用的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時檢測α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，選擇分離度較好的C4色譜柱，通過調整柱溫、色譜檢測條件，將α-乳白蛋白與β-乳球蛋白（A和B）徹底分離，為巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測提供一定依據與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：市售巴氏殺菌乳及其生產用生乳、市售滅菌乳。其中，巴氏殺菌乳為72 ℃條件下經15～30 s短時巴氏殺菌處理得到的液體產品[1-2]；生乳為從符合國家有關要求的健康奶畜乳房中擠出的無任何成分改變的常乳[18]；滅菌乳（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量約為200 mg/L）： 以生牛（羊）乳為原料，添加或不添加復原乳，在連續流動的狀態下，加熱到至少132 ℃并保持很短時間滅菌，再經無菌灌裝等工序制成液體產品[19]。

α-乳白蛋白標準品（純度≥94%）、β-乳球蛋白標準品（純度≥95%） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純）、鹽酸（優級純） 成都市科隆化學品有限公司；三氟乙酸（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有效公司；實驗室用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 儀器與設備

UItiMate 3000 HPLC儀（配備紫外檢測器） 美國 賽默飛公司；ME204分析天平、FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Synergy超純水機 德國Merk Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

移取10 mL巴氏殺菌乳樣品于100 mL燒杯中，加入25 mL 40 ℃水進行稀釋，用1.0 mol/L HCl調節pH值為4.6，然后轉移到50 mL容量瓶中，用水定容、過濾，濾液過0.22 μm水系濾膜，上機測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Xbridge Protein BEH C4柱（250 mm× 4.6 mm，3.5 μm）；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫60 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長210 nm；流動相A：體積分數0.1%三氟乙酸-水溶液，流動相B：體積分數0.09%三氟乙酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.3 標準溶液的配制

標準儲備液配制：α-乳白蛋白標準儲備液（1.0 mg/mL）： 準確稱取按其純度折算為100%的α-乳白蛋白標準品0.05 g，加水定容至50 mL容量瓶，并進行分裝，置于 -18～-20 ℃密封可保存1 個月；β-乳球蛋白標準儲備液（2.0 mg/mL）：準確稱取按其純度折算為100%的β-乳球蛋白標準品0.1 g，加水定容至50 mL容量瓶，并進行分裝，置于-18～-20 ℃密封可保存1 個月。

標準工作溶液配制：分別吸取適量的α-乳白蛋白標準儲備液、β-乳球蛋白標準儲備液，加水稀釋成α-乳白蛋白質量濃度分別為10、50、70、100、200、300、500 mg/L，β-乳球蛋白質量濃度分別為20、50、70、100、300、600、900 mg/L的混合標準工作溶液。

1.3.4 結果計算

試樣中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量按下式計算。

式中：X為試樣中α-乳白蛋白或β-乳球蛋白含量/（mg/L）；ρ為由標準曲線得到的樣品溶液質量濃度/（mg/L）；V定容為樣品溶液定容體積/mL；V樣品為樣品體積/mL。

1.4 數據處理

采用Excel和Origin軟件對數據和圖譜進行處理。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白沉淀溫度的選擇

根據牛乳中酪蛋白在其等電點溶解度最低的原理，在一定溫度下，將牛乳pH值調整到酪蛋白等電點，酪蛋白即發生沉淀，酪蛋白不溶于水和有機溶劑[20-21]，根據以上特性，采用酸沉淀法對酪蛋白進行沉淀，分離不變性的乳清蛋白。觀察20、30、40 ℃溫度下酪蛋白的沉淀效果及速率，確定水溫為40 ℃時稀釋樣品、進行pH值調節，樣品凝結更快，酪蛋白沉淀效果最好。

2.2 色譜柱的選擇

查閱文獻[22]、T/TDSTIA007—2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測定 液相色譜法》[23]選用安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱、資生堂Capcell PAK C18色譜柱、Waters Xbridge Protein BEH C4色譜柱，分別對質量濃度為100 mg/L 的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白混合標準工作液進行測定。

由圖1～3可知，相比較C18色譜柱，Xbridge Protein BEH C4色譜柱分離度較好。相同檢測條件下，采用Xbridge Protein BEH C4色譜柱時，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B能完全分離，且峰型好、方便積分。

圖1 安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱檢測α-乳白蛋白、 β-乳球蛋白HPLC圖譜Fig. 1 HPLC chromatogram of α-lactalbumin and β-lactoglobulin on Agilent Zorbax SB-C18 column

圖2 資生堂Capcell PAK C18色譜柱檢測α-乳白蛋白、 β-乳球蛋白HPLC圖譜Fig. 2 HPLC chromatogram of α-lactalbumin and β-lactoglobulin on Shiseido Capcell PAK C18 column

圖3 Xbridge Protein BEH C4色譜柱檢測α-乳白蛋白、 β-乳球蛋白HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatogram of α-lactalbumin and β-lactoglobulin on Xbridge Protein BEH C4 column

2.3 流動相體積比的選擇

采用體積分數0.09%三氟乙酸-乙腈溶液和體積分數0.1%三氟乙酸-水溶液作為流動相，參考T/TDSTIA 007—2019[23]、李慧[24]等的流動相梯度洗脫條件進行測定，α-乳白蛋白在10.70 min出峰，受雜峰影響，基線有偏移；β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B分別在18.83、21.10 min出峰，出峰時間較晚，整體運行時間較長。經確認，在多肽及蛋白質的反相液相色譜分離中，初始洗脫條件下流動相中有機溶劑體積分數較低，多肽及蛋白質與固定相間的疏水作用較強，多肽及蛋白質幾乎完全被固定相吸附。而一旦流動相中的有機溶劑達到特定的體積分數，使多肽或蛋白質與固定相的作用小于與流動相的作用時，多肽或蛋白質就會完全從固定相上洗脫下來，幾乎不再與固定相發生作用[25]。

故實驗過程中，將第1階段洗脫程序中0.1%三氟乙酸-水溶液體積分數增大[12]、加強雜質洗脫強度，減少α-乳白蛋白出峰處的雜峰干擾，同時整體運行時間從21.10 min縮短到14.90 min，峰型得到更好的改善。在兼顧保留時間和分離效果的前提下，將第1階段洗脫條件中0.1%三氟乙酸-水溶液體積分數增大至65%。

2.4 標準曲線和線性范圍

將不同質量濃度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白系列標準工作液在本研究確定的條件下測定。結果表明，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準曲線的相關系數均為0.999 9，線性良好。

2.5 加標回收率和精密度

在不含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的滅菌乳、巴氏殺菌乳中分別添加不同質量濃度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白標準品，每個樣品平行測定6 次（滅菌乳）或2 次（巴氏殺菌乳），計算加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表2可知：α-乳白蛋白加標量為200～1 032 mg/L 時，平均加標回收率為97.9%～104.0%、RSD為0.00%～1.09%；β-乳球蛋白加標量為600～4 727 mg/L 時，平均加標回收率為96.1%～103.0%，RSD為0.00 %～2.23%。

表2 滅菌乳、巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的 加標回收率與RSDTable 2 Recovery and RSD of added α-lactalbumin and β-lactoglobulin in sterilized milk and pasteurized milk

由表3可知，對市售巴氏殺菌乳進行6 次重復測定，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白RSD分別為0.48%和0.56%，說明該方法測定市售巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量具有很好的精密度。

表3 市售巴氏殺菌乳精密度測定結果（n=6）Table 3 Precision RSD for determination of α-lactalbumin and β-lactoglobulin in commercial pasteurized milk (n = 6)

2.6 定量限

在不含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的滅菌乳中分別添加理論含量為25 mg/L的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白標準品，進行定量限測定。由圖4可知，色譜圖雜質峰干擾較小，可進行準確定量測定，同時，RS/N≥10，確定該方法α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的定量限均為25 mg/L。

圖4 滅菌乳α-乳白蛋白、β-乳球蛋白加標樣品HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of sterilized milk spiked with α-lactalbumin and β-lactoglobulin

2.7 不同實驗室間測定結果比較

由表4可知，采用本方法測定3 個不同批次的巴氏殺菌乳，不同實驗室間測定結果無明顯差別，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定結果經格拉布斯檢驗法計算，均無離群值，表明方法穩定性好。

表4 不同實驗室間3 個不同批次巴氏殺菌乳測定結果Table 4 Comparison of results of different laboratories for α-lactalbumin and β-lactoglobulin in pasteurized milk

2.8 生乳和市售巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定結果

由表5可知，巴氏殺菌乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量均較生乳低。

表5 生乳與巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量比較Table 5 Comparison of α-lactalbumin and β-lactoglobulin contents in raw milk and pasteurized milk

3 結 論

建立一種適用于巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定的HPLC法。對參考T/TDSTIA 007—2019[23]的樣品前處理條件、色譜條件進行討論及合理優化。結果表明，該方法具有較好的準確度、精密度和重現性，適用于巴氏殺菌乳的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定。