根瘤菌對廣金錢草種子萌發及幼苗生長的影響

李娜 馬祝鏗 黃瑞華 劉瀟晗 陳汶釗 杜勤

摘 要：? 為探求促進廣金錢草萌發及生長的有效途徑，該文使用不同濃度的費氏中華根瘤菌、放射型根瘤菌以及田菁莖瘤固氮根瘤菌菌液分別浸染廣金錢草種子，以蒸餾水浸泡種子為空白處理，研究其對廣金錢草種子萌發指標（發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數）的影響，并在溫室培養40、60、80 d后分別測定廣金錢草幼苗的生長指標（葉片數、分枝數、株高）及部分生理指標（葉綠素含量、含氮量）的變化。結果表明：（1）在1×107 CFU·mL-1濃度條件下，三種菌液浸種均獲得最大萌發指標，其中田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組效果最顯著，發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數高于對照組16.00%、9.33%、9.51和41.34%。（2）除田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組外，其余實驗組的廣金錢草幼苗葉片數、分枝數及株高均低于對照組。（3）放射型根瘤菌實驗組和田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組幼苗葉綠素含量相比對照組分別增加1.47%和7.47%，含氮量分別增加0.57%和5.17%。綜上所述，三種根瘤菌菌液浸種均可在不同程度上提高廣金錢草種子的發芽能力和植株生長期的葉綠素和含氮量，其中田菁莖瘤固氮根瘤菌具有最大正向影響，可有效提高種子萌發能力并促進植株生長。該研究可為不同地區廣金錢草的種植和栽培提供技術指導，為開發田菁莖瘤固氮根瘤菌作為植物促生長菌劑提供理論支持。

關鍵詞： 廣金錢草， 根瘤菌， 萌發指標， 生長指標， 生理影響

中圖分類號：? Q945

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）11-1931-08

Soaking effects of rhizobia on seed germination and seedling growth of Desmodium styracifolium

LI Na， MA Zhukeng， HUANG Ruihua， LIU Xiaohan， CHEN Wenzhao， DU Qin*

（ College of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou University of Chinse Medicine， Guangzhou 510006， China ）

Abstract：? In order to explore the effective way to promote the germination and growth of Desmodium styracifolium， in this paper， different concentrations of Sinorhizobium fredii， Rhizobium radiobacter， Azorhizobium caulinodans were used to soak the seeds of Desmodium styracifolium，

effects of these three kinds of rhizobium solution on the germination indexes （germination rate， germination potential， germination index and vigor index） of D. styracifolium seeds were investigated with

the seeds soaked in distilled water as control check （CK）， and the growth indexes （number of blades， number of branches， plant height） and some physiological indexes （chlorophyll content， nitrogen content） of the seedlings were measured after 40， 60 and 80 d after transplant in greenhouse. The results were as follows： （1） Under the concentration of 1×107 CFU·mL-1， the maximum germination index could be obtained by soaking three kinds of rhizobium solution， among which the best germination rate， germination potential， germination index and vigor index in Azorhizobium caulinodans group were 16.00%， 9.33%， 9.51 and 41.34% higher than those in the control group. （2） The number of blades， number of branches and plant height of the seedlings treated by the Sinorhizobium fredii group and Rhizobium radiobacter group were lower than those of CK group， except for Azorhizobium caulinodans group. （3） The chlorophyll contents of Rhizobium radiobacter group and Azorhizobium caulinodans group increased by 1.47% and 7.47%， respectively， and the nitrogen contents increased by 0.57% and 5.17%， respectively. To sum up， the germination abilities， chlorophyll and nitrogen contents of the seeds of Desmodium styracifolium can be improved in different degrees by soaking the three rhizobia. Among them， Azorhizobium caulinodans group has the most positive effect， which could effectively improve the germination abilities of seeds and promote plant growth. This study can provide technical guidance for the planting and cultivation of Desmodium styracifolium in different areas， and provide theoretical support for the development of Azorhizobium caulinodans as a plant growth promoting agent.

Key words： Desmodium styracifolium， rhizobia， germination index， growth index， physiological effect

廣金錢草來源于豆科植物（Desmodium styracifolium），以干燥地上部分入藥，性微寒，味甘、淡，用于治療黃疸尿赤、小便澀痛，具利尿通淋、利濕退黃的功效（中國藥典，2015）。主要分布在廣東、廣西、四川、云南和福建等省（區）（廖紅梅等，2019）。目前研究主要集中于成分及藥理方面，廣金錢草主要含有黃酮、酚酸、生物堿、萜類、甾醇、揮發油、多糖等成分，具有較好的抗炎、抑制腎結石形成的作用，常作為排石利膽片等制劑的主藥（楊欣等，2019）。賴麗嫦等（2020）研究表明，廣金錢草總黃酮部分可有效降低模型大鼠血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）水平，抑制腎組織草酸鈣結晶的形成與沉積，減輕腎間質慢性炎癥，對腎功能起到保護作用。隨著人們對廣金錢草需求的不斷增加，野生資源透支趨勢越來越明顯（楊全等，2013）。現存野生資源已不能滿足人們的醫療需求及國內外眾多制藥企業對中藥原材料的需要，人們繼而進行人工種植來擴大產量。廣金錢草在廣東和廣西等地區有零散的種植，但未形成規模化生產，人工栽培技術的不完善及農藥化肥的濫用，導致藥材質量不穩定且污染土地（孫賢多等，2019）。隨著廣金錢草種植面積的擴大和產業化程度的提升，建立高產高質的人工輔助種植體系已迫在眉睫，篩選出提高種子萌發率和幼苗生長率的安全無害菌劑作為氮肥，對廣金錢草的質量、產量提高及環境保護具有重要意義。

根瘤菌與農作物的生產關系密切，其中至關重要的是同豆科植物的共生固氮（王二濤，2016）。這種互作方式不僅能減少氮肥的使用，增加土壤有機質含量，從而改善土壤生態環境，還可提高互作植物的抗逆性及抗病性，促進植株生長，有利于維持生態平衡（趙葉舟等，2013）。誘導根瘤菌與豆科及非豆科植物互作生產共生固氮優質種苗，是栽培育種的熱門研究方向（何國興等，2020）。本文采用浸染法、培養皿紙上發芽法以三種不同根瘤菌浸種的方式，研究其對種子的發芽情況、生長指標及生理指標的影響，篩選提高廣金錢草種子萌發能力的適宜菌液濃度及提高其產率、效率的優質菌種。本研究結果可為發掘優良根瘤菌種質資源提供實驗依據，為完善和提高廣金錢草的人工栽培技術提供理論支持和科學指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 種子和菌種 廣金錢草種子于2018年11月上旬購自廣東云浮栽培基地，經廣州中醫藥大學杜勤教授鑒定為豆科植物廣金錢草（Desmodium styracifolium）的種子;費氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii，編號：GIM1.227）、放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter，編號：GIM1.757）購于廣東省微生物保藏中心;田菁莖瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans，編號：ORS571）由西北農林科技大學劉華偉副教授提供。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：酵母提取物、次氯酸鈉、氯化鈉、胰蛋白胨等均為分析純，購自廣東鼎國生物科技有限公司。儀器：JJ300型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）;CX23型光學顯微鏡（OLYMPUS公司）;THZ-100B型恒溫培養搖床（上海一恒科學儀器有限公司）;FK-YL04型葉綠素測定儀（山東方科儀器有限公司）;血球計數板、pH計等實驗耗材均購自廣州華鑫儀器有限公司。

1.2 實驗設計

1.2.1種子萌發階段 優選籽粒飽滿且品質均勻的廣金錢草種子2 600粒，各200粒裝于13個玻璃瓶內。依次用75%的乙醇消毒30 s（精確計時，下同）后置于有效氯濃度為5.7%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水漂洗4次。將對數生長期的費氏中華根瘤菌用無菌水稀釋至1×106、1×107、1×108、1×109 CFU·mL-14個濃度梯度，各取20 mL分別裝入4個培養瓶中（放射型根瘤菌、田菁莖瘤根瘤菌以相同方式處理），空白對照組（control check ，以下簡稱“CK”）培養瓶中裝入20 mL蒸餾水，實驗組與CK組均浸泡24 h。之后將種子轉入貼好對應標簽、直徑9 cm的培養皿（鋪有2層濕紗布、1層濕濾紙）中，每個菌種的不同濃度分為4個培養皿且每皿整齊擺放50顆（4組平行實驗同時進行），加入6 mL對應處理液使紗布和濾紙飽和，將培養皿與種子一起稱定重量并記錄。以上步驟結束后將培養皿放置于光照培養箱，于28 ℃、濕度60%、12 h明/暗交替條件下培養。

試驗過程中要確保發芽床濕潤，每隔12 h加水至原重量，每隔24 h記錄種子的發芽數，染霉菌的種子用消毒的鑷子剔除，種子萌發結束后及時對幼苗鮮重、根長、株高進行測量，分析統計實驗數據后測得萌發指標，篩選種子萌發適宜的菌液濃度。

1.2.2 幼苗生長階段 從萌發結束的各菌種最適宜濃度培養皿中挑選萌發情況較好的3個培養皿，從每個培養皿中選出生長情況較好的3株幼苗，共36株幼苗。于2019年4月上旬將每株小苗單獨移入有等量營養土的花盆中，放置于恒溫（28±2）℃、恒濕60%的溫室大棚中培養，各實驗組與對照組分區擺放并編號。

待幼苗移入花盆后，每24 h記錄一次生長情況，適當澆水和去除雜草蟲蚜。從第40天開始測定生長指標（葉片數、分支數、株高）及生理指標（含氮量、葉綠素）（測定4片葉子的含氮量，剔除偏差較大的一個數據，其余3個數的平均值為最終數據，葉綠素同）。接下來每隔20 d（40、60、80 d）測一次生長指標及生理指標，得其變化曲線圖，在80 d同時統計幼苗成活率及保苗率。

1.3 指標及測定方法

1.3.1 種子萌發指標測定 胚根突破種皮表明萌發開始（王毅敏等，2021），連續2 d再無種子萌發視為萌發結束。以達到50%發芽率的天數為初次計數時間，以種子萌發數達到最多，再無萌發種子出現時的天數為末次計數時間。發芽率（%）=萌發試驗結束時正常發芽種子數/總供試種子數×100，發芽勢（%）=3天后正常發芽種子數/總供試種子數×100，發芽指數=浸種t日的發芽數/相應的發芽天數，活力指數（%）=發芽指數×幼苗生長量（本實驗使用長度）×100。

1.3.2 芽苗生長生理指標測定 株高使用皮尺測量，葉綠素及含氮量使用FK-YL04型葉綠素測定儀測定，以上數據與葉片數、分支數均取平均值為最終數據。

1.4 數據處理及分析

實驗數據及圖表均采用Excel軟件制作，SPSS（24.0）軟件進行統計分析，顯著性P<0.05。

2 結果與分析

2.1 菌液對種子萌發的影響

萌發結果如表1所示， 20 d后種子萌發結束，不同濃度菌種實驗組的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均高于CK組，證明該濃度梯度下三種不同菌液浸種對廣金錢草種子萌發均有正向影響。在相同濃度條件下，田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組各項數據均大于其余實驗組，濃度為1×107 CFU·mL-1的田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別達到最大值46.67%、20.00%、21.85、84.78%，與CK組相比依次提高了16.00%、9.33%、9.51和41.34%。而對比相同根瘤菌不同濃度組可知，除放射型根瘤菌實驗組在1×107、1×108 CFU·mL-1兩個濃度種子發芽率和發芽勢與CK組無顯著性差異外，其余實驗組在1×107 CFU·mL-1濃度條件下與其余濃度組及CK組差異顯著（P<0.05），可獲得最大萌發指標，該濃度下，種子萌發迅速整齊（圖版Ⅰ），故使用此濃度下萌發種子進行幼苗生長指標和生理指標的測定。

2.2 菌液對幼苗生長及生理指標的影響

由表2可知，幼苗生長40 d后，三組實驗組與CK組在葉片數上沒有顯著性差異， 植株均著生8片真葉，四組此時都未有分枝。田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組株高與CK組無顯著性差異，放射型根瘤菌實驗組植株最高，且與各組差異顯著（P<0.05），較CK組提高了16.87%。各實驗組均能促進廣金錢草體內葉綠素和含氮量的積累，田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組提高最多，葉綠素含量較CK組提高10.72%，含氮量提高11.93%。

幼苗生長60 d后，CK組獲得最多葉片（表3），田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組無分枝，其他兩組實驗組與CK組在分枝數上無顯著性差異，經費氏中華根瘤菌處理的植株在四組中最矮小。葉綠素含量和含氮量測定結果顯示，費氏中華根瘤菌實驗組和放射型根瘤菌實驗組與CK組無顯著性差異，而田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組與CK組差異顯著（P<0.05），對比CK組，該組葉綠素含量增長0.05%，含氮量增長0.51%。

80 d后，植株成活率及保苗率均在95%以上，對原始數據進行單因素方差分析，結果如表4所示，三種濃度為1×107 CFU·mL-1的根瘤菌對廣金錢草幼苗的生長有顯著性影響（P<0.05）。田菁莖瘤固氮根瘤菌浸種可顯著促進廣金錢草的葉片生長，除該實驗組外，費氏中華根瘤菌實驗組和放射型根瘤菌實驗組在分枝數上與CK組有顯著性差異（P<0.05），但都低于CK組，田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組、放射型根瘤菌實驗組及CK組可獲得最高植株，而費氏中華根瘤菌實驗組的植株最為矮小;在葉綠素含量和含氮量方面，放射型根瘤菌實驗組與CK組植株有相同含氮量，費氏中華根瘤菌實驗組含氮量低于CK組，田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組可獲得最高含氮量1.83 mg·g-1。

結合表2，表3，表4及圖版Ⅱ可知：濃度為1×107 CFU·mL-1的三種不同根瘤菌侵染的廣金錢草幼苗生長80 d后，費氏中華根瘤菌實驗組和放射型根瘤菌實驗組葉片數、分支數、株高均低于CK組，區別在于前者葉片數高于后者，而后者植株高度僅次于CK組;對兩者的生理指標進行分析，可知費氏中華根瘤菌實驗組對廣金錢草的葉綠素含量和氮素含量均有抑制作用，放射型根瘤菌實驗組在生理指標方面顯示出一定的促進作用，葉綠素含量和含氮量分別較CK組提高了0.25 SPAD和0.02 mg·g-1。三組實驗組中，田菁莖瘤固氮根瘤菌實驗組著生最多葉片，前60天該組葉片數低于CK組且無分枝，60 d后，葉片長勢迅速，近乎呈兩倍增長，與其余三組差異顯著（P<0.05），分枝數也在其后20 d內迅猛增長，最終與CK組數據接近一致;該處理也可顯著提高廣金錢草的生理物質含量，對比CK組，葉綠素增長7.47%，含氮量增長5.17%。從圖版Ⅱ中C，D兩個變化曲線還可看出，廣金錢草植株葉綠素含量和氮含量與其生長期有關，隨著植株生長期的增加，呈先緩慢增加后降低的趨勢。

3 討論與結論

傳統種植方法栽培廣金錢草，需要消耗大量化肥，致使土壤板結，肥力下降，嚴重影響廣金錢草的可持續發展。減少化肥使用，降低農業成本并實現生產的有機化是廣金錢草人工栽培技術的重要內容（孫賢多，2019）。Garcia et al.（2020）研究表明根瘤菌只需浸種或直接澆灌植物根部，就可定殖于植株體內，后期轉變為具有固氮能力的擬菌體，促進植物生長，形成根瘤菌與根之間的共生關系，是綠色環保的“生物氮肥”。本文使用最為常用的放射型根瘤菌、費氏中華根瘤菌和田菁莖瘤固氮根瘤菌侵染廣金錢草種子，研究其對種子萌發及植株生長的影響，開發適宜廣金錢草拌種及施用的促生菌劑。

根瘤菌浸染種子促其萌發的方法現代早有研究（陳文新等，2004），但還未對廣金錢草種子施行。不同根瘤菌入侵方式差異較大，定殖也為動態過程，根瘤菌可從植物傷口、氣孔、水孔等自然開口處入侵，有些根瘤菌分布于植物根部的表皮、維管組織及細胞等位置，甚至定殖于莖、葉及子房中（Rajesh et al.， 2020）。本實驗發現1×107 CFU·mL-1的費氏中華根瘤菌以及放射型根瘤菌處理雖然對種子萌發可產生一定促進作用，但會降低其發芽周期前3天內的萌發整齊度，而該濃度下田菁莖瘤固氮根瘤菌處理可顯著促進種子萌發，且萌發整齊度較好，該現象或受不同根瘤菌“入侵—定殖”過程的差異影響。本研究結果可為田菁莖瘤固氮根瘤菌直接拌種廣金錢草種子的實際生產提供理論依據。

根瘤菌與豆科植物及非豆科植物形成根瘤產生共生固氮作用已在多種植物中得到驗證（Vítor et al.， 2019;王倫等，2020），其具有溶磷能力且能分泌多種植物促生長激素，如玉米素、IAA、GA等（劉華偉等，2012），可使植株葉片增多以及提高植株生長高度。田菁莖瘤固氮根瘤菌不僅可在宿主根部形成根瘤還可在莖部形成莖瘤（楊學智，2019），除一般根瘤菌的特性外，還具有其他特點：它存在自生固氮和與宿主植物共生固氮的“雙重固氮”機制，既可自由吸收氮素，又可將氮素供給共生植物（Kyung-Bum et al.， 2008），這就賦予了田菁莖瘤固氮根瘤菌比其他菌種更為強大的生物固氮能力。本實驗的結論也驗證了前人觀點，經田菁莖瘤固氮根瘤菌侵染的廣金錢草植株，長勢從60 d開始與其余實驗組逐漸拉開差距，生長旺盛且枝葉茂密，且在四組數據中各項萌發指標和兩項生理指標（葉綠素含量和含氮量）最好。對于大部分非豆科植物來說， 根瘤菌不能與它們形成根瘤，而本實驗中1×107 CFU·mL-1的田菁莖瘤固氮根瘤菌浸種可使部分廣金錢草根部形成類根瘤狀的膨大，且少數植株基部分枝處出現了膨大，分枝偏多，葉片多，但同時也發現這部分植株偏矮小，導致株高平均值被拉低。該現象的出現或與根瘤菌定殖位點差異和各類促植物生長激素的形成及其向基性有關：石志棉等（2020）在實驗室早前研究中，通過綠色熒光蛋白gfp標記法發現田菁莖瘤固氮根瘤菌不僅能定殖于植物根部及附近土壤中，還可定殖于植物莖、葉、腺毛中，為植株生長提供氮源;劉薇等（2013）研究表明根瘤菌與宿主植物共生固氮系統形成后需要大量能量的參與，除宿主植物自身光合作用產生的碳水化合物外，還需要各類植物激素的相互協調，共同控制植物根瘤的形成。本研究中形成類根瘤和基部莖膨大的植株需要更多的植物激素參與固氮作用的消耗，導致促進植株生長的激素比重減少，從而發生了植株矮小的現象。植株中的葉綠素含量及氮含量與土壤中的含量呈正相關（胡喜巧等，2019），其含量隨植株生長期的增加，呈現先增加再降低的趨勢（Pijlman et al.， 2020），本研究中廣金錢草葉片葉綠素和氮含量在0～60 d期間緩慢升高，而在60～80 d期間明顯下降，原因是此期間植株生長旺盛，果實逐漸成熟，葉片中的氮素等營養物質迅速向果實轉移，影響了葉綠素的合成。

綜上所述，三種根瘤菌對廣金錢草種子的侵染均可在不同程度上提高廣金錢草種子的萌發指標和植株生長期的葉綠素含量和含氮量。在本文1×107 CFU·mL-1濃度條件下，放射型根瘤菌和田菁莖瘤固氮根瘤菌對種子萌發和生長有更好的促進作用，前者可明顯提高廣金錢草植株的株高，后者顯著提高葉片數、葉綠素含量和含氮量，并可出現類結瘤現象。初步研究發現田菁莖瘤固氮根瘤菌對苗期有良好效應，未來將針對成熟藥材的黃酮類成分進行分析比較，進一步研究后提出完善的施用固氮菌肥的技術方案。

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（責任編輯 周翠鳴）