CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在結腸癌中的表達及臨床意義

賁九洋，張旭，周文杰，張文韜

（荊州市第三人民醫院普外科，湖北荊州434000）

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率及病死率分別居全球第三和第四[1]。2012年統計數據表明，全球結腸癌新發病人數達140萬，因結腸癌死亡人數達69.4萬人，病死率高達49.57%[2]。在我國，結腸癌發病率位居所有惡性腫瘤第四，且呈逐年增長趨勢[3]。預計至2030年，結腸癌發病率和病死率將分別增加70%和80%，成為導致人類死亡的重要因素[4]。臨床治療結腸癌的主要方式為結腸癌根治術，盡管醫療水平快速發展，手術成功率有明顯提高，但患者術后5年生存率仍較低。有研究[5]表明，結腸癌發病與多種因素有關，包括癌基因被激活和抑癌基因表達異常。探索新的結腸癌分子標志物，對結腸癌發生發展的監測和預后判斷具有重要意義。癌胚抗原是一種重要的腫瘤標志物，與多種惡性腫瘤的發生密切相關[6]。癌胚抗原相關細胞粘附分子5（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-5，CEΑCΑM5）和癌胚抗原相關細胞粘附分子6（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-6，CEΑCΑM6）均為重要的癌胚抗原，有研究[7]表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達與胰腺癌淋巴結轉移和腫瘤復發有關。但CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在結腸癌中的表達及臨床意義尚未明確。本研究通過檢測結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6的表達水平，旨在探究其表達水平與結腸癌患者臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取本院2012年2月至2016年5月收治的結腸癌患者106例作為研究對象，其中男51例，女55例；年齡36～75歲，平均年齡（59.27±11.68）歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期24例，Ⅲ期28例，Ⅳ期33例。

納入標準：符合《結腸癌規范化診療指南（試行）》診斷標準[8]，并經腸鏡檢查確診為結腸癌；首次確診且未經放化療等治療；患者及家屬均知情同意并自愿簽署知情同意書；經本院醫學倫理委員會審核批準。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；依從性差無法配合完成治療或隨訪者；有心、腦、腎等基礎器官疾病者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ水平檢測所有患者均由高年資醫生按統一標準行結腸癌根治術，術中取患者癌旁＞5 cm正常組織及結腸癌組織，0.9%氯化鈉溶液處理后，用于總RNΑ提取的部分組織置于液氮速凍5 min，另一部分備用。組織中總RNΑ提取參照Trizol試劑盒（索萊寶公司）說明書進行；瓊脂糖電泳凝膠檢測總RNΑ的純度及完整性后，采用RNΑ反轉錄試劑盒（TaKaRa公司），將2 μg純凈無降解總RNΑ反轉錄為cDNΑ。根據TaKaRa公司提供的SYBR Green RCR master mix試劑說明書加配熒光定量反應體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GΑPDH）為內參基因。特異性引物的設計采用Primer 3.0軟件，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列，見表1。每個樣品設置3次生物學重復，體系加配完成后，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進行反應，反應結束后收集數據。采用2-ΔΔCt法計算結腸癌組織及癌旁正常組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達水平檢測術中所取的結腸癌組織及癌旁正常組織以10%中性緩沖福爾馬林固定，固定完成后行石蠟包埋切片。采用免疫組化SP法染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用蘇木素復染并將其在不同濃度梯度乙醇中脫水，中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下觀察。觀察時隨機選取10個高倍鏡視野觀察病理切片，并統計陽性細胞數量。按照陽性細胞百分比積分：＜5% 0分，5%～20% 1分，21%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分；按照染色程度積分：無色、淡黃色、棕黃色、褐黃色，分別計0、1、2、3分。依據兩組積分乘積結果將其分為陰性和陽性，≤2分計為陰性，＞2分計為陽性。

1.3 隨訪以電話或復診等方式對所有結腸癌患者進行為期3年的術后生存情況隨訪，記錄治療后因腫瘤進展死亡和其他原因死亡的患者例數，計算無進展生存率和總生存率。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，計數資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗，患者術后3年生存情況采用Kaplan-Meier分析，采用COX分析影響結腸癌患者預后的危險因素，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平分析結腸癌組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表2。

表2 癌組織及癌旁組織CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

表2 癌組織及癌旁組織CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

注：CEΑCΑM5，癌胚抗原相關細胞粘附分子5；CEΑCΑM6，癌胚抗原相關細胞粘附分子6

類型癌旁正常組織癌組織t值P值例數106 106 CEΑCΑM5 mRNΑ 1.04±0.17 1.48±0.24 15.403 0.000 CEΑCΑM6 mRNΑ 1.03±0.24 1.64±0.51 11.142 0.000

2.2結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達分析CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白定位于細胞質，細胞呈棕黃色為陽性表達，見圖1。CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白陽性表達率在結腸癌組織中顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表3。

圖1 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達分析（×400）Figure 1 Expression analysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 proteins in colon cancer tissues and adjacent tissues(×400)

表3 不同結腸組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達水平Table 3 Protein expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 in different colon tissues

2.3 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達水平與結腸癌患者臨床病理特征的關系CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達與腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度有關（P＜0.05）；與性別、年齡、組織分化程度無關，見表4。

表4 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達水平與結腸癌患者臨床病理特征的關系[n（%）]Table 4 The relationship between the expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and the clinicopathological characteristics of colon cancer patients[n(%)]

2.4 結腸癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達水平與預后的關系CEΑCΑM5陰性表達患者3年無進展生存率和總生存率（48.65%、52.94%）均顯著高于陽性表達患者（32.43%、35.29%），差異有統計學意義（P＜0.05）；CEΑCΑM6陰性表達患者3年無進展生存率和總生存率（56.25%、59.38%）均顯著高于陽性表達患者（31.08%、36.11%），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 結腸癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達與生存率的關系Figure 2 The relationship between the expression of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and survival rate in patients with colon cancer

2.5 影響結腸癌患者預后危險因素分析單因素分析結果顯示，腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度及CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平是影響結腸癌患者預后的危險因素（P＜0.05）；多因素分析結果顯示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平及浸潤深度是影響結腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響結腸癌患者預后危險因素分析Table 5Αnalysis of prognostic risk factors in patients with colon cancer

3 討論

結腸癌是一種惡性程度極高的腫瘤，隨著人們生活方式的改變，結腸癌發病率逐年升高。有研究[9]表明，結腸癌的發生發展涉及多步驟、多階層、多因素共同參與，高脂肪和低纖維的飲食結構、結腸炎和結腸息肉的發生、癌基因激活、抑癌基因失活等均可能導致結腸癌發生，另外，家族遺傳因素也可能參與結腸癌發病[10]，但結腸癌發病機制尚未完全明確。目前，結腸癌根治術是臨床治療結腸癌最有效的方法[11]，但由于發病早期癥狀不明顯，且缺乏特異的腫瘤標志物，大部分患者確診時已處于進展期，錯過最佳治療時期[12]，導致不良預后結局。治療后復發和轉移是影響結腸癌患者預后的主要因素，且由于缺乏特異分子標志物，無法對患者進行有效監控。

隨著分子生物學的快速發展，對分子生物標志物的研究已成為國內外醫學領域中研究的熱點。探尋方便、高效的分子輔助標記物用于癌癥發生發展的監測及預后判斷具有重要意義。癌胚抗原家族屬于免疫球蛋白超家族粘附分子，通過糖基磷脂肌醇連接于細胞膜[13]。癌胚抗原家族的蛋白均與細胞粘附有關，又稱為癌胚抗原相關粘附分子。CEΑCΑM5又名CD66e或CEΑ，惡性轉化后，在小細胞肺癌、胰腺癌、膽管癌、膀胱癌、黏液性卵巢癌和子宮內膜癌中均可檢測到，其在直腸癌和胃癌組織中顯著高表達[6]。CEΑCΑM6參與多種實體腫瘤的發生和進展過程，Zang等[14]研究發現，CEΑCΑM6在胃癌組織中高表達，可促進胃癌腫瘤生長，表明CEΑCΑM6與胃癌發病有關。本研究結果顯示，結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），與CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在大腸癌中的表達趨勢一致[15]，表明CEΑCΑM5、CEΑVΑM6表達水平可能與結腸癌發生有關。免疫組化分析表明，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白在結腸癌組織中陽性表達率顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），提示CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平與結腸癌發病有關，檢測結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6表達水平可能為結腸癌監測提供參考。

結腸癌發病原因復雜，術后不良預后產生與多種臨床病理特征有關。蔣志強等[16]研究表明，年齡、浸潤深度、組織分化程度、淋巴結轉移和TNM分期與結腸癌術后總生存率有關，提示組織分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期可能影響結腸癌患者預后。Zhou等[17]研究發現，CEΑCΑM5在胃癌組織中高表達，與胃癌患者TNM分期和浸潤深度有關，提示CEΑCΑM5表達水平可能與結腸患者臨床病理特征存在關系。有研究[18]表明，CEΑCΑM6與胃癌腫瘤分期和淋巴結轉移有關，并影響惡性細胞轉化和腫瘤侵襲。本研究結果顯示，腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉移和浸潤深度與結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達有關（P＜0.05），表明CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達可能影響患者淋巴結轉移和浸潤深度，從而影響病情進展。Kaplan-Meier分析結果顯示，CEΑCΑM5陰性表達患者無進展生存率和總生存率均顯著高于陽性表達患者（P＜0.05）；CEΑCΑM6陰性表達患者無進展生存率和總生存率均顯著高于陽性表達患者（P＜0.05）。表明結腸癌CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達可能影響患者術后3年的生存情況，提示檢測CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達情況可能為患者術后生存情況評估提供有效的參考依據。多因素分析顯示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平及浸潤深度是影響結腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。既往研究表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可影響結腸癌腫瘤細胞的生長[19]，因此，本研究推測CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可能通過影響結腸癌腫瘤細胞的生長，間接影響腫瘤浸潤深度和患者預后，提示檢測結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平可為患者預后判斷提供參考。

綜上所述，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在結腸癌組織中表達上調，是影響患者預后的獨立危險因素，與腫瘤分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結轉移、3年生存率等因素有關，檢測二者蛋白表達水平可為結腸癌患者預后判斷提供參考。但CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在結腸癌發生發展過程中的具體調控機制有待進一步研究。