實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)解脲脲原體的臨床價(jià)值分析

羅秀梅，李曉芳，王榮

（1.新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院（自治區(qū)生殖健康醫(yī)院）檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)于田縣婦幼保健站婦保科，新疆和田848400；3.新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院（生殖健康醫(yī)院）婦科，新疆烏魯木齊830000）

解脲脲原體（ureaplasma urealyticum，UU）是一種原核細(xì)胞微生物，為人類泌尿生殖道感染常見病原菌之一，會(huì)導(dǎo)致非淋球菌性尿道炎、前列腺炎、陰道炎、宮頸炎甚至不孕不育等不良后果[1]。目前，液體培養(yǎng)法是檢測(cè)UU的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法對(duì)樣本轉(zhuǎn)運(yùn)條件及時(shí)效性具有較高要求，可能存在部分假陰性情況[2]。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SΑT）是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[3]。基于此，本研究通過比較SΑT法與液體培養(yǎng)法、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)UU的靈敏度、特異度等，分析SΑT在UU檢測(cè)中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年5月至2020年5月于本院就診的疑似泌尿生殖道感染患者80例作為研究對(duì)象，其中男29例，女51例；年齡22～47歲，平均（34.60±8.58）歲。男性樣本為尿道拭子和尿樣，女性樣本為宮頸拭子和尿樣。所有患者均對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書。本研究已通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 采集標(biāo)本拭子標(biāo)本：以醫(yī)用棉拭子探入男性尿道口/女性宮頸口1～2 cm處，旋轉(zhuǎn)1周停留10 s后取出，將拭子頭置入1 mL 0.9%氯化鈉溶液中浸泡，并貼管壁擠干，取0.5 mL樣本滴入0.5 mL專用尿液保存液中混勻，即刻送檢或-20℃冷存待檢。

尿液樣本：取受檢者就診后次日1 mL清晨首次尿液或＞1 h未排尿后首段尿液，滴入1 mL專用尿液保存液中混勻，即刻送檢或-20℃冷存待檢。

1.2.2 試劑與儀器UU培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒[昌達(dá)生物高科技（上海）有限公司]、UU核酸檢測(cè)試劑盒[PCR熒光法，艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國羅氏LightCycler96）、UU核酸檢測(cè)試劑盒（RNΑ恒溫?cái)U(kuò)增法，上海仁度生物科技有限公司）。

1.2.3 檢測(cè)方法同一患者的拭子標(biāo)本采用液體培養(yǎng)法、qRT-PCR法、SΑT法檢測(cè)，尿液標(biāo)本則采用SΑT法檢測(cè)，所有檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說明書操作。

1.2.4 標(biāo)本檢測(cè)

1.2.4.1 液體培養(yǎng)法將拭子標(biāo)本置入1 mL UU專用培養(yǎng)基內(nèi)行洗脫操作，洗脫完成后取50 μL培養(yǎng)基滴入各孔內(nèi)，并放置于37℃，5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，觀察其顏色變化，若培養(yǎng)液中酚紅變紅，但培養(yǎng)液澄清不出現(xiàn)渾濁，表示陽性。

1.2.4.2 qRT-PCR法將拭子標(biāo)本洗脫液以4 400 g離心處理10 min，棄上清液，滴入50 μL裂解液，100℃下金屬浴10 min，再離心處理5 min，取上清液（DNΑ模板）備用。將獲得的上清液置入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系共40 μL，其中模板為6 μL，反應(yīng)條件為：37℃5 min，95℃5 min后循環(huán)擴(kuò)增，95℃15 s，60℃40 s，共循環(huán)40次。循環(huán)閾值（Ct）≤37表示陽性。

1.2.4.3 SΑT法取400 μL含有尿樣保存液的留存標(biāo)本滴入100 μL核酸提取液混勻，60℃恒溫放置5 min，室溫放置10 min，置入磁珠分離器內(nèi)靜置5 min，滴入洗滌液洗滌2次；滴加40 μL反應(yīng)液，提取RNΑ，將含磁珠的30 μL擴(kuò)增檢測(cè)液吸取至8連管內(nèi)，60℃恒溫放置10 min、42℃恒溫放置5 min，滴入10 μL預(yù)熱SΑT酶液，42℃實(shí)時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增40 min。閾值線和樣本曲線交點(diǎn)處橫坐標(biāo)數(shù)值（dt）≤35表示陽性。

1.3觀察指標(biāo)以液體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析并比較SΑT、qRT-PCR檢測(cè)UU效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 種方法檢測(cè)結(jié)果比較液體培養(yǎng)法結(jié)果顯示，80例患者中31例（38.75%）UU檢測(cè)呈陽性，49例（61.25%）UU檢測(cè)呈陰性；31例UU陽性患者中SΑT（拭子）檢出29例，檢出率為93.55%，SΑT（尿樣）檢出27例，檢出率為87.10%，qRTPCR檢出28例，檢出率為90.32%；3種檢測(cè)方法檢測(cè)UU陽性表達(dá)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 3種方法檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 SΑT與qRT-PCR檢測(cè)效能比較SΑT（拭子）、SΑT（尿樣）、qRT-PCR檢測(cè)UU的靈敏度、特異度、誤診率、漏診率、正確指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 SΑT與qRT-PCR檢測(cè)效能比較

3 討論

近年來，UU導(dǎo)致的泌尿生殖道感染發(fā)生率呈增長趨勢(shì)，其致病性與血清型及生物群有關(guān)[4]。UU中的脲酶通過分解尿素所提供的能量生成氨氣（NH3），對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生急性毒性作用[5]。

目前，多以液體培養(yǎng)法檢測(cè)UU，此方法主要通過UU分解尿素生成堿性NH3使酚紅變紅的特性判斷UU感染情況，但此方法無法做到純分離，且同種液體培養(yǎng)基無法同時(shí)判斷2種以上的支原體感染[6]。PCR為一類核酸檢測(cè)方式，具有較高的敏感性、特異性，但因其檢測(cè)靶標(biāo)是UU DNΑ，而DNΑ的穩(wěn)定性較高，需2～3周才完全分解，因此，有時(shí)患者已治愈但PCR結(jié)果仍呈假陽性[7]。

SΑT是結(jié)合了核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的新型核酸檢測(cè)技術(shù)，SΑT較常規(guī)PCR而言，因RNΑ在環(huán)境中較不穩(wěn)定，短時(shí)間即可分解，可快速、準(zhǔn)確地判斷出病原菌感染及治療效果[8]。此外，SΑT檢測(cè)的標(biāo)本可為泌尿生殖道分泌物或尿樣，而尿樣為非侵入性的一種取樣標(biāo)本，不但明顯減輕患者痛苦，且減少了醫(yī)生的工作量[9]。

本研究結(jié)果表明，SΑT（拭子）檢出率為93.55%，SΑT（尿樣）檢出率為87.10%，qRT-PCR檢出率為90.32%；3種檢測(cè)方法檢測(cè)UU陽性表達(dá)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SΑT（拭子）、SΑT（尿樣）、qRT-PCR檢測(cè)UU的靈敏度、特異度、誤診率、漏診率、正確指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示SΑT技術(shù)可與液體培養(yǎng)法及qRT-PCR法互相替代，且尿樣標(biāo)本可替代拭子標(biāo)本[10]。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)解脲脲原體具有較高的靈敏度、特異度，且取材方便、檢測(cè)快速、污染較低、結(jié)果準(zhǔn)確，值得臨床推廣應(yīng)用。