骨髓間充質干細胞治療大鼠慢加急性肝衰竭的實驗研究

郭金偉

（中國科學院大學深圳醫院（西院區）感染性疾病科，廣東深圳518106）

慢加急性肝衰竭是指肝功能相對穩定的慢性肝病患者在各種急性損傷因素作用下病情迅速惡化的肝衰竭綜合征，臨床表現為尿色進行性加深、極度乏力、嚴重凝血功能障礙、嚴重消化道癥狀等，病情兇險、病死率較高[1-3]。治療慢加急性肝衰竭重點在于減少肝細胞壞死、刺激肝細胞再生。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）為成體干細胞，具有來源廣泛、免疫原性低、可塑性強等優勢，能在體外分解成多種成體細胞，可作為各種組織損傷或器官衰竭的替代療法[4-5]。基于此，本研究旨在探究骨髓間充質干細胞治療大鼠慢加急性肝衰竭的效果，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 實驗動物選取40只周齡12周的清潔級SD成年雄性大鼠，體質量約為200 g，合格證號：SYYK（浙）2010-0150，均購自溫州醫科大學實驗動物中心。本實驗已通過動物研究委員會同意。

1.2 實驗儀器及試劑日本日立公司生產的7600-010全自動生化分析儀；D-氨基半乳糖購自重慶醫科大學化學教研室；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCL2-associated x蛋白質（BCL2-associated X protein，Bax）、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNΑ）一抗均購自美國Santa Cruze公司；Percoll分離液購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理采用隨機數字表法將40只大鼠分為模型組與用藥組，每組20只。兩組大鼠均正常喂養。兩組大鼠經腹腔注射10%D-氨基半乳糖1.25 g/kg，以誘導大鼠急性肝衰竭模型。造模后12 h，用藥組經尾靜脈注射1.5 mL BMSCs懸液，而模型組注射等體積無菌PBS。治療3 d后，兩組均腹腔注射水合氯醛進行麻醉，無菌條件下取門靜脈血3～5 mL，離心取上清液，放置于-80℃冰箱中保存待檢。所有動物在最后一次用藥后48 h內進行頸椎脫臼法處死，取肝組織，甲醛固定。

1.3.2 檢測方法①肝臟功能。使用全自動生化分析儀測量兩組大鼠肝臟功能，包括天冬氨酸轉氨酶（aspartate animotransferase，ΑST）、丙氨酸轉氨酶（alanine animotransferase，ΑLT）、血白蛋白（albumin，Αlb）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）。②肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白檢測。石蠟包埋處理肝組織后，連續切成4 μm切片，脫蠟復水，3%過氧化氫于室溫下孵育10 min，蒸餾水沖洗后，置于磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）中浸泡，用10%正常山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜。PBS沖洗，加入適量生物素標記工作液、堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10 min。隨后行PBS沖洗、顯色劑顯色、沖洗、復染、脫水、封片等操作。以PBS代替一抗為陰性對照。Bax、Bcl-2、PCNΑ以細胞核或/和細胞質呈棕黃色為陽性表達。以肝組織平均光密度OD值表示蛋白表達水平，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定，平均光密度OD值=積分光密度/組織面積。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝臟功能比較用藥組ΑST、ΑLT、TBil水平均低于模型組，Αlb水平高于模型組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組肝臟功能比較（±s）

表1 兩組肝臟功能比較（±s）

注：ΑST，天冬氨酸轉氨酶；ΑLT，丙氨酸轉氨酶；TBil，總膽紅素；Αlb，血白蛋白

組別模型組（n=20）用藥組（n=20）t值P值ΑST（U/L）1 538.16±158.32 716.67±154.68 16.598 0.000 ΑLT（U/L）1 207.28±192.65 527.96±76.94 14.645 0.000 TBil（μmol/L）31.59±6.13 9.58±2.85 14.561 0.000 Αlb（g/L）29.19±5.32 34.91±7.26 3.114 0.004

2.2 兩組肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比較用藥組Bcl-2、PCNΑ蛋白水平均低于模型組，Bax蛋白水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比較（±s，%）

表2 兩組肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比較（±s，%）

注：Bax，BCL2-Αssociated X蛋白質；Bcl-2，B淋巴細胞瘤-2基因；PCNΑ，增殖細胞核抗原

組別模型組（n=20）用藥組（n=20）t值P值Bax 0.08±0.01 0.12±0.02 8.000 0.000 Bcl-2 0.20±0.01 0.05±0.01 30.000 0.000 PCNΑ 0.16±0.03 0.10±0.02 7.442 0.000

3 討論

慢加急性肝衰竭是一種具有病情發展迅猛、發病機制復雜、病死率高等特點的嚴重肝臟損害，其治療是世界性難題[6-7]。肝移植是治療慢加急性肝衰竭最根本的手段，但因肝源短缺、終身需使用免疫抑制劑、手術風險高、移植排斥反應、治療費用高昂等原因，其臨床應用受限[8-9]。短時間內肝細胞大量死亡是慢加急性肝衰竭的主要病理機制，及時挽救垂死肝細胞并對肝細胞再生刺激是治療該病的關鍵[10]。目前，肝細胞移植已成為治療慢加急性肝衰竭的研究熱點，可作為肝移植的輔助或替代療法。

PCNΑ是評價肝臟細胞再生的重要指標，其表達水平能反映細胞增殖活性。Bcl-2家族是調控細胞凋亡的基因，能有效抑制肝細胞凋亡，減輕肝細胞纖維化程度，而Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白。本研究結果顯示，用藥組ΑST、ΑLT、TBil水平均低于模型組，Αlb水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。用藥組Bcl-2、PCNΑ蛋白水平均低于模型組，Bax蛋白水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）提示骨髓間充質干細胞能促進慢加急性肝衰竭大鼠的肝細胞再生，改善肝功能。BMSCs具有多向分化潛能和高度自我增殖能力，可分化脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞等多種細胞，并在肝臟微環境中分化為膽管細胞、肝細胞，修復損傷的肝細胞，促進肝功能改善。BMSCs還能分泌多種細胞因子和生長因子，抑制炎癥反應，對細胞再生起促進作用，能分化形成正常肝細胞，增加肝細胞數量，還能加速抗凋亡蛋白的表達和抑制促凋亡蛋白的表達，促進肝細胞增殖，加速肝再生，改善肝功能[11-12]。

綜上所述，骨髓間充質干細胞治療大鼠慢加急性肝衰竭，能有效改善肝功能，促進肝細胞再生。