原代藏獒細胞培養與生物學特性研究

劉文凱，田 玲，喬自林，李 鈾，王家敏，王明明

（1.西北民族大學 生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學工程學院，甘肅 蘭州 730030）

各國特有的物種基因資源，早就成為世界關注和爭奪的焦點，許多國家己經將基因資源庫的建設列為未來社會可持續發展以及打贏未來經濟戰的戰略建設工程。藏獒原產于青藏高原，分布于海拔3 000～5 000 km的嚴寒地帶，屬于國家二級保護動物[1]。極端惡劣的生活環境造就了藏獒特殊的身體構造和生理特性[2]。這是藏獒可以在惡劣生存環境中維持協調統一性狀并匹配環境多樣性的主要原因[3]。目前，對藏獒的研究多集中于培育養殖、品種鑒定等方面，細胞、分子水平的研究相對較少[4]。

近年來，為了了解細胞增殖與衰老的分子機制，為治療腫瘤、控制腫瘤細胞增殖以及器官移植等奠定基礎，或使傳代困難、增殖慢、易衰老的細胞獲得永生，獲得更多的細胞資源，細胞永生化研究成為熱點。細胞永生化（cell immortalization）指體外培養的細胞經過自發的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離, 從而具有無限增殖能力的過程。通過基因轉染等技術將外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等，導入目的細胞內, 以增加永生化的發生率, 進而建立永生化細胞株（immortalized cell strains），以達到使體外培養的細胞具有無限增殖能力且細胞間無差異的目的[5]。

染色體的數目與核型是細胞穩定傳代的關鍵，是能夠用來鑒別細胞種類特征的關鍵標準[6]。病毒介導方式的永生化可能會使細胞的染色體數目發生缺失或增加。因此，對細胞進行染色體分析也是確定其穩定傳代的因素之一。

該研究利用實驗室前期自主分離的藏獒腎臟細胞，探討了其體外培養的形態特征、傳代次數、凍存復蘇、生長特性、細胞核型以及G418最低致死濃度，為藏獒腎臟細胞永生化的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年2—6月在西北民族大學生物工程細胞中心實驗室進行。以實驗室前期自主分離的藏獒腎臟細胞為材料，采用10%胎牛血清配置的細胞培養液在T25細胞培養瓶中進行培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 原代細胞傳代按照細胞生長情況及時更換新鮮細胞培養液進行傳代培養，等細胞生長密度達85%～90%以上時按照1∶3的比例進行傳代培養，適時觀察拍照，并記錄細胞生長狀態，著重記錄F2、F5、F10代細胞狀態。

1.2.2 細胞凍存與復蘇把凍存管放在37℃的水浴中快速搖動，在90 s內搖動至融化，混勻離心后放入T25細胞培養瓶加入新鮮培養基，24 h后更換新鮮培養液，至細胞生長密度達到85%～90%時，加入胰酶進行消化，然后離心保留細胞，加入細胞凍存液，按照4℃10 min、-20℃30 min、-80℃過夜、液氮永久保存的順序緩慢凍存。

1.2.3 細胞生長特性觀察將F3代、F5代、F10代細胞分別接種至六孔板中，待生長密度達70%～80%時，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態特征，對比細胞傳代前后的差異，并拍照記錄。

1.2.4 復蘇細胞活率測定取3只凍存后的F4代細胞，用臺盼藍染色法，將待檢細胞復蘇后制成細胞懸液，按1∶1比例混勻，加入細胞計數板中，活細胞細胞結構完整，透明無色，死細胞均為藍色。每只凍存管計數3次，加入細胞計數板后，利用細胞計數儀計算活率，即為細胞活力。

1.2.5 細胞生長曲線繪制取2瓶生長密度至85%的F3代細胞按照1×104個/孔加入24孔細胞培養板孔中，每日更換培養液，進行細胞計數，取3個平行樣的均值，以培養時間作為橫坐標，以細胞密度作為縱坐標，利用prism軟件，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 G418最低致死濃度篩選取生長狀態良好F3代細胞，在24孔培養板中按照1×104個/孔的標準，當細胞鋪展率約為50%～60%時加入含有不同濃度G418的篩選培養基，G418濃度區間為0～1 000 μg/mL，以100 μg/mL為一個梯度配置11個不同的篩選濃度。每2 d更換篩選培養基，顯微鏡下觀察并記錄細胞生長狀況，第14天能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最低致死濃度。

1.2.7 核型分析將形態與生長狀態良好的F3代細胞接種至6孔培養板，加入秋水仙素溶液處理6 h；經過胰酶消化后，加入預熱的氯化鉀吹打，置于37℃培養箱靜置30 min；棄去氯化鉀，加入固定液，1 500 r/min離心5 min；反復3次后吸取重懸液從50 cm高處滴至玻片上，立刻在酒精燈上過3～5個來回，風干30 min；用10%的Giemsa染液染色20 min后，在蒸餾水下進行沖洗，之后在倒置顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

通過傳代培養，每代細胞按照1∶3比例進行傳代，保證每代細胞最少有5瓶，并對生長良好的F2、F3、F5、F8代細胞進行凍存。觀察發現，細胞形態均為成纖維細胞，形狀梭形（圖1），呈放射狀與旋渦狀樣式生長，經過復蘇后形態與長勢均呈現良好狀態。觀察還發現，F1代至F5代，細胞增殖較快，呈放射狀生長，細胞呈梭形，長勢良好；F5代至F8代，細胞增殖減弱甚至停滯，細胞呈多邊形狀態，出現細胞脫落現象，最終于F8代無法繼續生長。

圖1 F3、F5、F8代藏獒腎臟細胞的生長狀態比較

2.2 復蘇細胞活率測定

藏獒細胞凍存前平均活力為 97%，凍存2個月后取3支細胞進行復蘇，測出的平均活力為 91%。

2.3 細胞生長曲線繪制

如圖2所示，藏獒組織細胞生長狀況較好，生長曲線呈“S”型，細胞生長均符合體外細胞生長規律。按照細胞群體倍增時間的公式：PDT=t×lg2/(lgNtlgN0)。其中，t表示培養時間，N0表示第一次所得的細胞數目，Nt代表示培養t時間后的細胞數目。由此可得細胞的倍增時間為27 h。

圖2 F3代藏獒腎臟細胞的生長曲線

2.4 G418最低致死濃度篩選

為了后續永生化試驗陽性細胞的篩選，在培養液中分別添加0～1 000 μg/mL的G418， 每100 μg設置1個梯度，培養F3代藏獒腎臟細胞14 d，結果表明，500 μg/mL濃度組及更大濃度組的細胞在第14 天全部死亡，表明500 μg/mL可作為G418篩選藏獒腎臟細胞的最低致死濃度（圖3）。

圖3 不同濃度的G418處理對F3代藏獒腎臟細胞的影響

2.5 核型分析

由圖4可知，正常的藏獒腎臟細胞染色體數目為2n=78，包括38對常染色體和1對性染色體。

圖4 正常藏獒腎臟細胞的染色體

3 討 論

犬這個物種的起源一直是生物界關注的熱點，經過多方論證，目前學界已有共同認知，即：所有家犬均來自于灰狼[7]。目前，有對牧羊犬、阿拉斯加等犬的細胞進行體外培養，但藏獒細胞體外培養相關案例較少[8]。動物體細胞的體外培養會受到許多因素的影響，如培養環境、培養方法等。細胞的染色體改變也會對增殖能力產生巨大影響[9]。細胞生長曲線能夠較好地展示細胞數目的改變，在細胞生長過程中也可通過糖耗來反映細胞的活力，從而明確細胞的狀態[10]。

該研究表明，藏獒腎臟細胞體外培養時形態均為成纖維細胞，形狀梭形，呈放射狀與旋渦狀樣式生長，經過復蘇后形態與長勢均呈現良好狀態；F1代至F5代，細胞增殖較快，呈放射狀生長，細胞呈梭形，長勢良好；F5代至F8代，細胞增殖減弱甚至停滯，細胞呈多邊形狀態，出現細胞脫落現象，最終于F8代無法繼續生長；生長曲線測定結果顯示，24孔板內細胞數目最高值達到4.06×105個/mL，最短倍增時間為27 h，說明細胞生長速度較快。

動物體細胞在體外培養的條件下，隨著傳代數目的增多，染色體數目可能發生變化[11]。體細胞染色體的倍增數目與動物細胞的培養方式有關[12]。藏獒成纖維細胞的染色體研究，對藏獒的分類和繁衍有重大參考價值。根據圖像軟件排序，可展示藏獒細胞染色體的數目和形態特征[13]。但是，藏獒細胞染色體的玻片標本還具有無法輕易看出的染色體，目前在技術上還存在一些難點，無法進行深入研究，后續可通過熒光探針等方法進行深入探索[14]。

G418是一種糖類抗生素，與卡那霉素、氨芐霉素的構造相近，可通過對80S核糖體的調控而阻止蛋白質的生成，對細胞具有毒性，是篩選穩定細胞系最常用的試劑[15]。帶有neo基因的細胞通過轉染具有免疫后，能夠抵抗帶有G418的篩選培養基[16]。目前，G418的這種功能在基因敲除、基因過表達等領域有較高的應用價值[17]。結果顯示，500 μg/mL及以上濃度的G418處理組，藏獒細胞在培養第14天即全部死亡，表明500 μg/mL可作為G418篩選藏獒腎臟細胞的最低致死濃度。

實驗室前期采用組織塊法構建了藏獒腎臟組織細胞系，細胞凍存代次均在3代以內，形態較好。復蘇后細胞活力均保持在90%以上。該研究利用實驗室前期自主分離的藏獒腎臟細胞，探討了其體外培養的形態特征、傳代次數、凍存復蘇、生長特性、細胞核型以及G418最低致死濃度，明確了藏獒腎臟細胞自發傳代的最終代次，發現了自發傳代中存在的問題，為后續的病毒感染篩選打下了基礎，同時也為進一步研究藏獒細胞的生物學特性奠定了基礎。