垂柯霉素對結腸癌細胞增殖、遷移能力的抑制及其分子機制

莊琢琛，佟鑫，蘇麗婭，白利平

·論著·

垂柯霉素對結腸癌細胞增殖、遷移能力的抑制及其分子機制

莊琢琛，佟鑫，蘇麗婭，白利平

100050 北京，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所國家衛生健康委員會抗生素生物技術重點實驗室（莊琢琛、佟鑫、白利平）；010050 呼和浩特，內蒙古醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心（佟鑫、蘇麗婭）

探究垂柯霉素對結腸癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響和分子機制。采用垂柯霉素對人結腸癌 HCT116、RKO 和 HT29 細胞作用，通過細胞克隆形成實驗測定對細胞增殖能力的影響，通過細胞劃痕愈合實驗測定對細胞橫向遷移能力的影響，通過 Transwell 細胞侵襲實驗測定對細胞縱向侵襲能力的影響，通過 Western blot 實驗檢測結腸癌細胞中 P-LRP6、CycD1、Met 和 C-myc 蛋白表達的變化。細胞克隆形成實驗結果表明，垂柯霉素可以顯著抑制結腸癌細胞的克隆形成能力，降低細胞增殖能力。細胞劃痕愈合實驗和 Transwell 細胞侵襲實驗結果表明垂柯霉素可以顯著抑制細胞的橫向遷移及縱向侵襲能力。Western blot 實驗結果表明垂柯霉素可降低 LRP6 的磷酸化，降低下游蛋白CycD1、Met 和 C-myc 的表達，闡明了垂柯霉素抑制結腸癌細胞增殖的分子機制。垂柯霉素通過降低 LRP6 的磷酸化降低Wnt 通路下游蛋白表達，進而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

結腸癌； 垂柯霉素； 細胞增殖； LRP6； Wnt

癌癥是嚴重威脅人類生命和健康的重要非傳染性疾病之一，在中國也是主要的公共衛生問題之一。國際癌癥研究機構發布的全球癌癥排名顯示，結腸癌已成為發病率排名第三的癌癥，其死亡率也僅次于肺癌。近年來結腸癌的發病率及死亡率在各個國家和地區也呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類的生命健康[1-2]。結腸癌由多方因素引發，其發生和發展是由多基因和細胞通路改變共同作用的結果。目前結腸癌的治療主要采取手術和放化療為主的綜合治療，傳統的化療藥物對患者的預后作用很有限，病人化療耐藥情況時有發生，而且對腫瘤的轉移或術后復發的治療仍有局限性[3]。因此，對結腸癌重要的分子和信號通路的研究，以及新型治療方法的探索顯得尤為必要。

結腸癌的發生涉及多種信號通路，其中 Wnt 信號通路在胚胎發育中具有重要作用，同時也調節多種成人組織的自我更新與穩態維持。Wnt 信號通路主要包括三種途徑，其中經典的 Wnt 途徑通過調節 β-catenin 的水平來調節關鍵基因水平，從而發揮作用[4-5]。如圖1 所示，Wnt 信號進入胞內后，將信號傳遞給Dishevelled（Dvl），活化的Dvl 抑制由大腸腺瘤性息肉病（APC）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）、軸突抑制物（Axin）和酪蛋白激酶 1（CK1）組成的復合物的活性，使 β-catenin 不能被GSK-3β 磷酸化，而在胞漿內集聚并進入到細胞核，與T 細胞因子/淋巴增強結合因子（TCF/LEF）家族的DNA 結合，介導靶基因的轉錄激活[6-7]。而當有 Wnt 小分子配體結合后，會減少 GSK-3β 所在的復合物解體，減少 β-catenin 進入細胞核影響下游蛋白的表達[8]。現已發現多個 Wnt 通路靶基因，如 MMP7、CD44、CycD1、C-myc、c-Jun、Met 等[6-7]，這些靶基因可以影響腫瘤血管的形成、細胞的遷移與侵襲、干細胞的維持、上皮-間質轉化、免疫逃逸和耐藥等。因此，發現靶向 Wnt 通路的抑制劑或轉錄拮抗劑對于結腸癌治療具有重要意義。

垂柯霉素（trichomicin）是本實驗室從木霉菌屬哈茨木霉（）中分離得到的新結構小分子化合物，結構式如圖 2 所示，已獲得發明專利，專利號為 200510082974.X。前期的體外研究證實垂柯霉素具有顯著抗炎和抗腫瘤活性，可抑制巨噬細胞 IL-6 和 TNF-α 的轉錄及分泌，抑制結腸癌及腫瘤基質細胞中 JAK/Stat3 和IKK/NF-κB 通路，從而抑制結腸癌生長[9-10]。本研究通過細胞生物學實驗和 Western blot 法分析了垂柯霉素對結腸癌細胞的侵襲和遷移能力及相關調控的分子機制，對探究結腸癌的發生機制及防治均有重要意義，以期為開發小分子化合物作為治療手段提供理論依據。

圖 1 垂柯霉素抑制結腸癌中經典 Wnt 信號通路的機制圖

Figure 1 Proposed mechanistic scheme of trichomicin suppressing the canonical Wnt signaling pathway in colorectal cancer

圖 2 垂柯霉素化學結構式

Figure 2 The structure of trichomicin

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶消化液（含 EDTA）購自 Gibco 公司；細胞培養基、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、磷酸鹽緩沖液均購自 Hyclone 公司；30% 丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、10 × 電泳緩沖液、10 × 電轉移緩沖液、封閉專用脫脂奶粉、牛血清白蛋白 BSA、5 × 蛋白上樣緩沖液、RIPA 裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑、BSA 蛋白定量標準品、BCA 蛋白定量試劑盒購自普利萊基因技術有限公司；過硫酸銨購自北京化工廠；預染分子量 marker 購自美國 Thermo 公司；化學發光 HRP 底物購自美國 Millipore 公司；結晶紫購自日本 Nacalai tesque 公司；4% 多聚甲醛通用型組織固定液購自 Biosharp 公司；甲醇購自北京市通廣精細化工公司。

兔抗人抗體 P-LRP6（2568）、CycD1（2978）、Met（8198）、C-myc（5605），鼠抗人抗體 GAPDH 購自 Cell Signal Technology 公司；抗鼠抗體 Goat Anti Mouse IgG、抗兔抗體 Goat Anti Rabbit IgG 購自金普萊公司。

1.1.2 儀器與耗材 AE2000 倒置顯微鏡購自德國 Leica 公司；ChemiDocTMImaging System 凝膠成像系統、Power Pac Hc 蛋白電泳電源、Mini PROTEANTEtra system 蛋白電泳槽、CriterionTMBlotter Western blot 轉膜儀購自美國 Bio-Rid 公司；Legend Micro 17 臺式微型超速離心機、CO2細胞培養箱購自美國 Thermo Fisher 公司；Centrifuge 5430R 臺式溫控微量超速離心機購自德國 Eppendorf 公司；TDZ5-WS 臺式低速離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；IncuCyte 長時間動態活細胞成像儀購自美國 Essen BioScience 公司；TS-8 水平搖床購自海門其林貝爾公司；BT 25S 電子精密分析天平購自德國 Sartorius公司；MINIC-1001 迷你金屬浴購自杭州米歐儀器有限公司；0.45 μm PVDF 膜購自美國 Millipore 公司；3422 Transwell 嵌套（6.5 mm，8.0 μm）、細胞培養瓶、細胞培養板等細胞實驗耗材均購自美國 Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人結腸癌 RKO、HCT116 和HT29 細胞均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，RKO 細胞使用 MEM 培養基，HCT116 細胞使用 IMEM 培養基，HT29 細胞使用 DMEM/Ham’s F-12 培養基，均加入 10% FBS 和 1% 雙抗，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞融合度達 80% ～ 90% 進行傳代，用 PBS 洗滌細胞，并在胰蛋白酶消化后以 1000 r/min 離心 1 min 收獲細胞，隨后按比例分裝至新培養瓶中，于培養箱中繼續培養。

1.2.2 細胞克隆形成實驗 將細胞以 2500 個/孔接種至六孔板中，加入含垂柯霉素的培養基，濃度為 2.5、5 和 10 μmol/L，每個濃度設置 3 個復孔；同時設置不含垂柯霉素的對照組。將細胞放入培養箱中培養 2 ～ 3 周。當形成細胞克隆集落時終止培養，用 0.1% 的結晶紫染液染色 20 min，再用 PBS 漂洗至背景透明，進行拍照計數。以≥ 50 個細胞/集落為標準計算克隆形成率，克隆形成率（%）=（細胞集落數/初始接種細胞數）× 100%。

1.2.3 細胞劃痕愈合實驗 取對數生長期的 HCT116 和 RKO 兩種細胞用胰酶消化，調整細胞密度接種至 96 孔板中，使其于培養箱過夜孵育后鋪滿板底。次日用 PBS 洗滌細胞兩次，將 96 孔板放入劃痕盒中，進行劃痕操作。隨后經 PBS 洗滌劃痕產生的細胞碎片，加入含 10 μmol/L垂柯霉素和不含垂柯霉素的無血清細胞培養基，放入 IncuCyte 長時間動態活細胞成像儀中，每 4 ～ 6 小時拍照記錄，根據收集圖片數據分析實驗結果，計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=（0 h 細胞劃痕面積– 不同時間后細胞劃痕面積）/ 0 h 細胞劃痕面積 × 100%。

1.2.4 Transwell 細胞侵襲實驗 首先以含10 μmol/L濃度的垂柯霉素和不含垂柯霉素的培養基處理細胞 24 h，然后在不含 FBS 的培養基中饑餓處理細胞 12 h。用 Matrigel 基質膠包被 Transwell 小室底部膜的上室面以模擬細胞外基質，用不含 FBS 的培養基將細胞密度調整為 1 × 104個/ml，取 200 μl 細胞懸液加至 Transwell 小室的上室中；在下室加入 600 μl 含 10% FBS 的培養基，置于培養箱中孵育 24 h，每個濃度設置 3 個平行。培養結束后，用 0.1% 的結晶紫染色液室溫染色 20 min，經 PBS 漂洗至細胞不再脫色為止，用濕棉簽擦去基質膠和 Transwell 小室膜上層細胞，在顯微鏡下觀察并拍照計數。

1.2.5 Western blot 實驗檢測蛋白水平變化 將細胞以 4 × 105個/孔的密度接種于六孔板，用濃度為2.5、5 和 10 μmol/L的垂柯霉素處理 24 h，同時設置不含垂柯霉素的對照組。隨后將細胞用 RIPA 緩沖液裂解并煮沸 5 min，使用 BCA 蛋白質測定試劑盒定量蛋白濃度。將蛋白提取物進行 SDS-PAGE，然后轉移至 PVDF 膜。用 5%脫脂牛奶封閉后，將膜分別與P-LRP6（2568）、Met（8198）、CycD1（2978）、C-myc（5605）、GAPDH（D3018）一抗在4 ℃下孵育過夜。次日使用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育 1 h，在待測 PVDF 膜上方滴加 HRP 底物發光液后，利用 ChemiDocTMImaging System 凝膠成像系統進行掃描。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 垂柯霉素抑制細胞克隆形成

垂柯霉素對 HCT116、RKO 和 HT29 細胞的克隆形成率影響見圖 3，3 種細胞的對照組克隆形成率分別為 15.0% ± 0.4%、10.8% ± 0.2% 和 36.2% ± 3.6%。隨著垂柯霉素濃度增加，細胞克隆形成能力逐漸減弱，其中 HT29 細胞在 2.5 μmol/L 的垂柯霉素處理后克隆形成率與對照組呈顯著性差異（< 0.05），在5 μmol/L 的垂柯霉素處理后與對照組呈極顯著差異（< 0.01）；HCT116 與 RKO 細胞 2.5 和 5 μmol/L 組分的克隆形成率均與對照組呈極顯著差異（< 0.01）；在垂柯霉素濃度達 10 μmol/L 時，細胞幾乎不再形成克隆集落，表明垂柯霉素能夠顯著抑制結腸癌細胞的增殖。

2.2 垂柯霉素對 Wnt 通路的抑制

圖 4 為不同濃度垂柯霉素處理 HCT116、RKO 和 HT29 細胞后，不同蛋白的表達情況。正常情況下，Wnt 通路激活后 LRP6 會被磷酸化，使得 P-LRP6 表達升高，促進 Axin/APC/GSK-3β 復合物解體，使得 β-catenin 不能被磷酸化，進而下游靶蛋白增多。而當垂柯霉素作用后，觀察到下游的 CycD1、Met 和 C-myc 蛋白的表達減少，說明垂柯霉素可以抑制 Wnt 通路下游蛋白的表達。此外，垂柯霉素還使得 P-LRP6 表達下降，說明垂柯霉素可能是通過 LRP6 磷酸化減少，進而減少了復合物的解體，抑制了 β-catenin 進入細胞核，從而抑制下游靶蛋白的表達。

Figure 3 Effects of different concentration of trichomicin on the colony formation of HCT116, RKO and HT29 cells (*< 0.05,**< 0.01)

Figure 4 Different concentration of trichomicin inhibits the Wnt pathway in HCT116, RKO and HT29 cells

2.3 垂柯霉素抑制細胞劃痕愈合能力

由于細胞克隆形成和 Western blot 實驗中10 μmol/L 濃度的垂柯霉素對細胞增殖及蛋白表達的抑制作用最強，因而后續實驗均采用 10 μmol/L 濃度的垂柯霉素進行。如圖 5 所示，10 μmol/L 濃度的垂柯霉素作用于 HCT116 和 RKO 細胞后，細胞的遷移能力受到明顯抑制。經 48 h 孵育后，HCT116 和 RKO 細胞經垂柯霉素作用后劃痕愈合率雖有上升，但均明顯低于對照組的 100% 劃痕愈合率；其中 HCT116 細胞經垂柯霉素作用后于6 h 和對照組呈顯著差異（< 0.05），12 ～ 48 h 均與對照組呈極顯著差異（< 0.01），RKO 細胞于8 ～ 48 h 均與對照組呈極顯著差異（< 0.01）。以上表明垂柯霉素能夠明顯抑制結腸癌細胞的劃痕愈合能力。

Figure 5 Influence of trichomicin on the migration of HCT116 and RKO cells

Figure 6 Effects of trichomicin on HCT116 and RKO cells invasion (**< 0.01)

2.4 垂柯霉素抑制細胞侵襲

細胞侵襲實驗結果如圖 6 所示，垂柯霉素作用于 HCT116 和 RKO 細胞后，細胞的穿膜數量均明顯減少。對比穿膜細胞數量發現，10 μmol/L 的垂柯霉素處理細胞時，100 倍顯微鏡下 HCT116 侵襲細胞數為 191.3 ± 49.1，顯著低于對照組 688.0 ± 99.1（< 0.01）；RKO 侵襲細胞數為 120.7 ± 17.0，顯著低于對照組608.3 ± 105.7（< 0.01），表明垂柯霉素能夠抑制結腸癌細胞的縱向侵襲能力。

3 討論

Wnt 信號異常與多種癌癥直接相關，包括結直腸癌、黑素瘤和肝細胞癌[11]。在結直腸癌中，Wnt 信號通路通過誘導腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲在癌癥進展中起重要作用，可作為結腸癌治療的治療靶標[12-13]。現已開發出多種 Wnt 信號通路抑制劑用于結腸癌治療，包括天然產物（如維生素 D 和姜黃素）、非甾體抗炎藥、小分子藥物（如 MSAB和HI-B1）和生物制劑（如單克隆抗體 OMP-18R5 和 OMP-54F28）[13-15]。本文中選用的垂柯霉素是本課題組從木霉菌屬哈茨木霉中分離得到的小分子化合物，對結腸癌細胞中的 JAK/Stat3 和 IKK/NF-κB 通路有抑制作用，具備顯著的抗炎和抗腫瘤活性[10]。

小分子藥物正廣泛應用于腫瘤的治療，其具有靶向性強，對正常組織的毒性較小的特點，因此成為預防和治療癌癥的更好選擇。課題組先前已經通過人結腸癌細胞 HT29 裸鼠移植模型抗瘤實驗證明，垂柯霉素能抑制 HT29 裸鼠移植瘤的生長，不同組間腫瘤組織中細胞因子檢測結果顯示，垂柯霉素作用后的腫瘤組織中 IL-6 及 TNF-α 含量顯著降低[9]。本文中，首先通過細胞克隆形成實驗、細胞劃痕愈合實驗和 Transwell 細胞侵襲實驗證實了垂柯霉素可以顯著抑制結腸癌細胞的克隆形成能力、劃痕愈合能力以及縱向侵襲能力。為探究垂柯霉素抑制細胞增殖的分子機制，通過 Western blot 實驗發現，經垂柯霉素處理的人結腸癌 HCT116、RKO 和 HT29 細胞中 P-LRP6 蛋白的表達降低，說明垂柯霉素降低了 LRP6 的磷酸化，減少GSK3β/APC/Axin/CK1 復合物的解體，進而使得進入細胞核中的β-catenin 減少，從而降低下游蛋白CycD1、Met 和 C-myc 的表達，闡明了垂柯霉素抑制結腸癌細胞增殖的分子機制。

綜上所述，本研究對垂柯霉素處理后的人結腸癌細胞進行了研究，分析了垂柯霉素對結腸癌細胞增殖和遷移能力的影響。結果表明，垂柯霉素通過抑制 Wnt 通路 LRP6 磷酸化，使得下游 CycD1、Met 和 C-myc 蛋白的表達減少，從而對細胞的克隆形成能力及細胞遷移和侵襲能力都有明顯的抑制作用，并且隨著垂柯霉素劑量的增加，抑制作用更明顯。本研究不僅通過細胞表型實驗證實了垂柯霉素能夠抑制結腸癌細胞的增殖和遷移，還探究了垂柯霉素調控結腸癌的分子機制，對于探討結腸癌的發生機制及防治均具有重要意義。

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6):394-424.

[2] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[3] Lawdmann RG, Weiser MR. Surgical management of locally advanced and locally recurrent colon cancer. Clin Colon Rectal Surg, 2005, 18(3):182-189.

[4] Rodriguez-Salas N, Dominguez G, Barderas R, et al. Clinical relevance of colorectal cancer molecular subtypes. Crit Rev Oncol Hemat, 2017, 109:9-19.

[5] Clevers H, Nusse R. Wnt/β-catenin signaling and disease. Cell, 2012, 149(6):1192-1205.

[6] Clevers H. Wnt/β-catenin signaling in development and disease. Cell, 2006, 127(3):469-480.

[7] Reya T, Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature, 2005, 434(7035):843-850.

[8] Giles RH, van Es JH, Clevers H. Caught up in a Wnt storm: Wnt signaling in cancer. Biochim Biophys Acta, 2003, 1653(1):1-24.

[9] Qi XQ, Zhu FC, Zhang Y, et al. Study of a novel compound 2460A with activities produced by fungus. Acta Pharm Sinica, 2011, 46(2): 165-169. (in Chinese)

齊小強, 朱鳳昌, 張洋, 等. 真菌來源新活性化合物2460A的研究. 藥學學報, 2011, 46(2):165-169.

[10] Zhao X, Qi X, Lian W, et al. Trichomicin suppresses colorectal cancer via comprehensive regulation of IL-6 and TNFα in tumor cells, TAMs, and CAFs. Front Pharmacol, 2020, 11:386.

[11] Yost C, Torres M, Miller JR, et al. The axisinducing activity, stability, and subcellular distribution of beta-catenin is regulated in Xenopus embryos by glycogen synthase kinase 3. Genes Dev, 1996, 10(12): 1443-1454.

[12] Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature, 2012, 487(7407):330-337.

[13] Cheng X, Xu X, Chen D, et al. Therapeutic potential of targeting the Wnt/beta-catenin signaling pathway in colorectal cancer. Biomed Pharmacother, 2019, 110:473-481.

[14] Hwang SY, Deng X, Byun S, et al. Direct targeting of β-catenin by a small molecule stimulates proteasomal degradation and suppresses oncogenic Wnt/β-Catenin signaling. Cell Rep, 2016, 16(1):28-36.

[15] Shin SH, Lim DY, Reddy K, et al. A small molecule inhibitor of the β-Catenin-TCF4 interaction suppresses colorectal Cancer growth in vitro and in vivo. EBioMedicine, 2017, 25:22-31.

The inhibitory effect of trichomicin on the proliferation and migration of colon cancer cells and its molecular mechanism

ZHUANG Zhuo-chen, TONG Xin, SU Li-ya, BAI Li-ping

NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (ZHUANG Zhuo-chen, TONG Xin, BAI Li-ping); Clinical Medical Research Center, The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, China (TONG Xin, SU Li-ya)

To explore the effect and molecular mechanism of trichomicin on colon cancer cell proliferation, invasion and migration.Human colon cancer HCT116, RKO and HT29 cells were treated with trichomicin. Effect of trichomicin on cell proliferation, migration and invasion were determined by cell clone formation assay, wound healing assay and Transwell invasion assay, respectively. The changes of P-LRP6, CycD1, Met and C-myc protein expression were detected by Western blot in the colon cancer cells.Trichomicin could significantly inhibit the colon cancer cell clone formation, thereby reducing the ability of cell proliferation. According to the results of wound healing assay and Transwell invasion assay, trichomicin could significantly inhibit the horizontal migration and vertical invasion of cells. Trichomicin could reduce the phosphorylation of LRP6 and the expression of proteins CycD1, Met and C-myc, as confirmed by the Western blot results.Trichomicin reduces the expression of proteins in the Wnt pathway by reducing the phosphorylation of LRP6, thereby inhibiting the proliferation, migration and invasion of colon cancer cells.

colorectal cancer; trichomicin; proliferation; LRP6; Wnt

BAI Li-ping, Email: lipingbai1973@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.003

“重大新藥創制”國家科技重大專項（2018ZX09711001- 007-003）

白利平，Email：lipingbai1973@163.com

2021-02-26