江蘇省某市部分農村河道水體和污水處理廠主要工藝環節病毒污染狀況調查

陳曉峰， 朱 迅， 馮微宏， 丁新良， 錢燕華*， 許秋瑾

1.無錫市疾病預防控制中心(南京醫科大學附屬無錫疾病預防控制中心)， 江蘇 無錫 214023 2.中國環境科學研究院，環境基準與風險評估國家重點實驗室， 北京 100012 3.南京醫科大學全球健康中心， 江蘇 南京 211166

水環境中已知的病毒、細菌、原生動物等病原生物超過140種，一些病原微生物的感染、傳播可以導致人類疾病的暴發. 全世界沿海區域中的水源性病原生物每年會造成大約300萬傷殘調整壽命年，即約120億美元的經濟損失[1]. 水環境中常見的導致腹瀉的病毒有諾如病毒(norovirus，NV)、輪狀病毒(rotavirus，RV)、札如病毒(sapovirus，SaV)、腺病毒(adenovirus，AdV)、星狀病毒(astrovirus，AstV)和腸道病毒〔enterovirus，EV，包括脊髓灰質炎病毒(polioviruses)、柯薩奇病毒(coxsackie viruses)和艾可病毒(echoviruses)〕等. 水源性病毒主要來自人畜糞便、生活及城市的污水污染，由于病毒的非細胞屬性，其在適宜的水環境中可以存活幾周，并大多數可以感染人類[2]. 2015年US EPA頒布的飲用水污染物候選清單CCL4列入了NV在內的多種病毒污染物，表明水環境中存在的病毒對公眾健康的影響日益受到關注. 近年來，很多國家和地區發生了多起因水體諾如病毒污染而引起的腹瀉病事件[3-8]. 同時，我國城鎮污水處理廠目前采用的污水處理工藝并不能完全去除污水中的病毒[9-10]. 江蘇省某市自然水網分布廣泛，且每年時有諾如病毒疫情發生，因而非常有必要了解江蘇省某市自然水體、沉積物、污水處理廠各工藝段出水及污泥中病毒的季節性分布特征以及種類分布情況，筆者于2019年4—12月對該市農村自然河道水體和污水處理廠主要工藝環節水樣以及污泥、沉積物進行為期9個月的病毒污染狀況監測采樣，以確定農村河道水體和污水處理廠主要工藝環節病毒的污染狀況，并分析病毒污染與水環境常見理化因素之間的相關性，以研究病毒的水環境影響因素，以期為水環境中病毒的監測及其生態環境與人體健康風險評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集時間為2019年4—12月，樣品采集頻次為每月1次，共采集并檢測90份樣本，其中水體樣本63份，污泥樣本9個，沉積物樣本18份. 水樣采集和保存按HJ 91—2002《地表水和污水監測技術規范》和HJ/T 493—2009《水質樣品的保存和管理技術規定》執行，每月下旬采樣，用有機玻璃采樣器取水面以下20 cm處樣品20 L，放入潔凈的采樣桶. 沉積物樣本用彼得森采泥器(PBS-411，武漢彼德森科技有限公司)在固定點位采集500 g. 現場使用YSI 550A 野外便攜式溶氧儀(550A，美國YSI 公司 )測定水體的水溫和DO(溶解氧). 樣品及采集點位信息見表1.

表1 樣品及采集點位信息

1.2 樣品處理

1.2.1水樣處理

在10 L原始水樣中加入濃度為2 mol/L的MgCl2溶液，使Mg2+終濃度為0.1 mol/L，充分攪拌混合均勻；采用真空抽濾使水樣以0.1 L/min的速度通過孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素濾膜[11].

1.2.2污泥與沉積物樣品處理

取污泥或沉積物樣本10 g，加入50 mL提取劑(pH=9.4)(沉積物終濃度為0.1 g/mL)，提取劑中含有3%牛肉浸膏、0.05 mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、5 mmol/L 檸檬酸(C6H8O7)；在振蕩培養箱中恒溫(4 ℃)、恒速(300 r/min)連續旋轉振蕩30 min，然后輕輕將其混合液轉移至高速離心管中，調節pH至9.4，4 ℃ 下以 10 000 r/min(即 12 096g)高速離心30 min，上清液調節pH為7.2～7.4；上清液經過Cetrion plus 70超濾管濃縮至2 mL，對超濾濃縮后的病毒液提取核酸[12].

1.3 RNA提取與RT-PCR檢測

1.3.1RNA提取

將膜浸入pH=3.5的鹽酸溶液中，5 min后取1/4大小的膜剪碎(最后病毒量換算時再乘以4)，用1 mL Tralk洗脫液(0.05 mol/L KH2PO4，1.0 mol/L NaCl，0.1% Triton X-100，pH=9.2)在4 ℃下浸泡過夜洗脫，取200 μL洗脫液提取RNA，RNA提取按試劑盒說明書操作.

1.3.2熒光定量RT-PCR檢測

使用ABI 7500實時熒光PCR儀(Prism? 7500，美國ABI公司)對每份樣本進行檢測，熒光PCR試劑盒選用深圳生科原股份有限公司生產的輪狀病毒、諾如病毒(G Ⅰ、G Ⅱ)三重核酸檢測試劑盒(貨號：SKY-8413)[11]以及札如病毒、星狀病毒、腺病毒三重核酸檢測試劑盒(貨號：SKY-8412)和腸道通用核酸檢測試劑盒(貨號：SKY-8301). 反應中所用陰陽性質控樣品來自試劑盒，體系配置和PCR反應條件可參考試劑盒說明書.

1.4 理化檢測方法

水樣采集后自然沉降30 min，取上層非沉降部分進行分析. TN濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法進行測定；TP濃度采用為鉬酸銨分光光度法進行測定；COD濃度采用為重鉻酸鉀法進行測定；pH采用為玻璃電極法進行測定；EC按照《水和廢水監測分析方法》(第四版)相關方法進行測定.

1.5 數據處理及分析

采用SPSS 15.0軟件進行描述性分析和卡方檢驗、相關性分析，P<0.05有統計學意義.

2 結果與分析

2.1 不同類型病毒檢出率

在檢測的90份樣本中：NV G Ⅱ檢出份數最多，為33份，檢出率為36.67%；其次是EV，為27份，檢出率為30.00%；其他類型病毒檢出率均低于10%. NV G Ⅱ檢出率與EV檢出率無統計學差異(P>0.05)，NV G Ⅱ和EV占據了腹瀉病毒檢出率的前兩位.

2.2 不同樣本類型中病毒檢出率

在63份水體樣本中，有28份檢出NV G Ⅱ，檢出率為44.44%，有22份檢出EV，檢出率為34.90%，其他類型病毒檢出率均低于10.00%. 27份污泥和沉積物樣本中，有5份檢出NV G Ⅱ，檢出率為18.50%；5份檢出EV，檢出率為18.50%；其他類型病毒檢出率均低于10.00%. 水樣與底泥中NV G Ⅱ的檢出率差異有統計學意義(P<0.05)，其他種類病毒在水樣與底泥中的檢出率差異無統計學意義(P>0.05)(見表2).

表2 不同樣本類型病毒檢出情況

2.3 污水處理廠主要工藝環節水體病毒檢出情況

污水廠進水、膜處理后出水(未消毒)和消毒出水各有9份水樣，共計27份水樣，其中15份檢出NV G Ⅱ，11份檢出EV，NV G Ⅰ、RV、SaV、AdV各有2份檢出，AstV未檢出(見表3). 進水(W5)中有4份檢出NV G Ⅱ，檢出率為44.44%；有3份檢出EV，檢出率為33.33%. 膜處理后水(未消毒)(W6)中有6份檢出NV G Ⅱ，檢出率為66.67%；有3份檢出EV，檢出率為33.33%. 消毒出水(W7)樣品共9份，其中NV G Ⅱ和EV各5份檢出，檢出率為55.56%(見表3). 不管污水處理前或處理后，NV和EV始終占據檢出病毒的前兩位，前后檢出率并無統計學差異(P>0.05).

表3 污水處理廠各環節水體病毒檢出情況

2.4水溫與病毒檢出率的相關性

通過相關性分析得出，水溫升高，NV G Ⅱ檢出率降低，反之水溫降低，NV G Ⅱ檢出率增加，二者呈顯著負相關 (P<0.05)，其他種類的病毒與水溫并無明顯相關性. DO、TP、TN、COD濃度和EC、pH均與病毒檢出率無統計學差異.

3 討論

污水中諾如病毒的污染狀況普遍存在，且檢出率差異很大. 鄧麗麗等[13]在廣西南寧市朝陽溪中檢出諾如病毒，程莉等[14]在北方某市環境水體中檢出輪狀病毒，尉秀霞等[15]在北京市豐臺區環境污水監測中發現腸道病毒. 筆者于2020年4—12月在江蘇省某市農村河道水體和污水處理廠主要工藝環節(水樣和污泥樣品)中均有檢出病毒，其中以NV G Ⅱ(檢出率為36.67%)和EV(檢出率為30.00%)為主，提示這些水體中有潛在病毒暴露風險.

該研究中富集病毒采用了最常用的病毒吸附洗脫法(VIRADEL)中的陰離子膜吸附洗脫法，相比鋁鹽沉淀、PEG沉淀等方法耗時更短，病毒富集過程中損失更小，成本相對較低，更適用于基層對水中病毒的監測工作[16].

所采集樣品中NV G Ⅱ的檢出率為36.67%，NV G Ⅰ 的檢出率為6.67%，NV的總檢出率達到43.34%，提示NV G Ⅱ可能是引起該城市人群腹瀉的優勢病毒. 據日本相關報道，NV在污水(未處理水)中的檢出率在90%以上，檢出率居第二位的就是腸道病毒(EV)，占到65%[17-18]；另外，美國相關研究報道，污水中NV的檢出率也在80%以上，EV檢出率在50%以上[19]. 這些結果與筆者得到的江蘇省某市農村河道及污水處理廠水體中病毒檢出率的排序是一致的，表明NV和EV是在污水中最常見的兩種病毒，遠超其他種類的腹瀉病毒. 由于我國該市樣品中包含了經過水廠處理的水，所以檢出比率大大低于日本相關報道數據(其樣本中只包括了污水)，這一結果揭示了NV感染的重要來源.

此次研究中污水處理廠消毒出水中NV、EV和RV均有檢出，表明該污水處理廠目前使用的消毒處理工藝并不能完全去除病毒，這與張德友等[9]發現北京市污水處理廠再生水RV檢出率的結論類似. 美國科學家發現小于25 ppm的氯處理工藝對于水中病毒的去除效果有限[20]，周進宏等研究顯示，城市污水處理廠對星狀病毒的去除率為93.15%[10]，如果加上離子吸附洗脫效果或者臭氧處理病毒去除效果更好[21-22].

此次研究結果也顯示，NV G Ⅱ的檢出率呈隨水溫的升高而降低的特點. 這與NV感染腹瀉病冬春季高發的結論[23-24]相一致，有研究表明，諾如病毒是熱敏感的病毒，高溫能加速諾如病毒的失活或死亡[25-27].

此次研究開展于2019年4—12月，考慮2020年后新冠肺炎疫情發生，消毒劑大量使用以及殘留的消毒劑可能會滲透入土壤及進入環境水體，今后的研究中應考慮殘留消毒劑是否會對環境水體中病毒的檢出率產生影響，以及是否會對人體健康造成相關風險[28].

4 結論

a) 江蘇省某市農村河道及污水處理廠主要工藝環節水樣、沉積物及污泥樣品中，諾如病毒G Ⅱ檢出率為36.67%，腸道病毒檢出率為30.00%，其他病毒檢出率均低于二者.

b) 水溫與諾如病毒G Ⅱ檢出率呈顯著負相關(P<0.05).

c) 江蘇省某市農村河道水體中存在病毒污染，諾如病毒G Ⅱ為優勢毒株. 采集到的污水處理廠出水中有諾如病毒G Ⅱ、腸道病毒和輪狀病毒檢出，污水處理廠出水通常排入就近的城市河道中. 因此，夏季人群在接觸城市河道水體時，有潛在病毒暴露風險.