甘薯塊根多酚高效測定技術優化與應用

高志遠 胡亞亞 韓美坤 張 靜 于翠紅 趙俊梅,2 劉蘭服 焦偉靜 馬志民

(河北省農林科學院糧油作物研究所；河北省作物遺傳育種實驗室1，石家莊 050035) (河北科技大學生物科學與工程學院2，石家莊 050018) (河北省種子總站3，石家莊 050031)

甘薯作為全球種植的主要作物之一，是重要的糧食、飼料、工業原料及新型能源作物[1]。甘薯營養成分豐富，含有淀粉、蛋白質、多酚、維生素、纖維素等，具有營養保健作用[2，3]。多酚是甘薯諸多營養保健成分之一，因其結構中含有多個酚羥基而具有良好的抗氧化活性及清除自由基的作用，據研究報道甘薯多酚具有明顯的抑菌活性和抗氧化作用[2-7]。另外多酚類化合物還具有抗癌、降血脂、抗衰老等眾多作用，被稱為人類健康的“第七營養素”，因此逐漸成為研究的熱點[8，9]。

多酚含量測定的方法有很多，福林酚比色法因其靈敏度高、穩定性好而廣泛應用[10-13]，其原理為在堿性溶液中，鎢鉬酸可以將多酚類化合物定量氧化，自身被還原(使W6+變為W5+)生成藍色的化合物，顏色的深淺與多酚含量呈正比[14，15]。目前，已有研究分別用福林酚比色法測定了甘薯不同部位的多酚含量，但均為分光光度計測定[16-18]。隨著科學技術的發展，酶標儀的應用越來越廣，它具有效率高、操作簡單的特點，避免了反復清洗比色杯，同時減少試劑使用量，節約成本[19-22]。胡煒等[23]采用酶標儀結合福林酚法測定了葡萄皮的多酚含量。然而，研究報道的福林酚法測定多酚含量的條件差異較大[24]。

建立甘薯多酚高效測定方法是開展甘薯種質及育種后代篩選評價的基礎，對于高多酚甘薯品種的開發利用具有重要意義。因此，本研究將酶標儀與福林酚法結合，優化反應體系和時間，以建立甘薯多酚測定的高效方法，并對所保藏的甘薯種質資源進行多酚含量測定，為選育高多酚甘薯品種，更好地開發利用甘薯種質資源提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯：本實驗室保存的甘薯種質資源83份。

沒食子酸標準品及福林酚試劑；乙醇、碳酸鈉(Na2CO3)均為分析純。

FSJ-A03D1粉碎機，TG16G臺式高速離心機，SynergyMx多功能酶標儀，96孔板，eppendorf微量移液器。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

沒食子酸母液：取沒食子酸標準品10 mg加蒸餾水定容至10 mL棕色容量瓶，質量濃度為1 mg/mL，避光存放于-20 ℃冰箱。

沒食子酸工作液：以1 mg/mL沒食子酸母液分別配制質量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的沒食子酸工作液。

1.2.2 樣液的制備

參考GB/T 8313—2008[25]方法并有所改進，取同品種大小均勻的3個薯塊，洗凈，晾干，去皮，采用四分法取樣，擦絲，用粉碎機打碎，分別稱取1.00 g，加70%乙醇溶液2 mL研磨均勻，轉入10 mL離心管，用2 mL70%乙醇溶液沖洗研缽2次，將沖洗液均轉入10 mL離心管，混勻后立即70 ℃水浴，浸提10 min (隔5 min混勻一次)，浸提后冷卻至室溫，5 000 r/min離心10 min，上清液轉移至10 mL容量瓶，殘渣用5 mL 70%乙醇溶液提取，重復以上操作。合并提取液定容至10 mL，混勻，即為樣液。

1.2.3 提取溶劑濃度的確定[26]

配制40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，參考上述方法，對甘薯塊根多酚進行提取，以確定最優提取溶劑濃度。

1.2.4 樣品測定條件優化[27]

參考GB/T 8313—2008[25]，分別取不同濃度的沒食子酸工作液、蒸餾水(空白對照)及樣液各200 μL于5 mL離心管，各3個平行，分別加入1 mL 10%福林酚試劑，搖勻，反應5 min，加入800 μL 7.5%碳酸鈉溶液搖勻，室溫下避光放置60 min，在96孔板中每孔加入330 μL，在765 nm波長測定吸光度。

1.2.4.1 碳酸鈉溶液濃度的確定

分別配制2.5%、5%、7.5%、10%、15%碳酸鈉溶液，以確定的最適濃度乙醇提取甘薯多酚，按上述方法進行實驗測定，加入不同濃度的碳酸鈉溶液反應，以確定最優碳酸鈉溶液濃度。

1.2.4.2 福林酚濃度的確定

分別配制2.5%、5%、10%、15%、20%福林酚溶液，以確定的最適濃度乙醇提取甘薯多酚，按上述方法進行實驗測定，加入不同濃度的福林酚進行反應，加入確定濃度的碳酸鈉溶液后，對甘薯多酚含量進行測定，以確定最適福林酚濃度。

1.2.4.3 反應時間的確定

按確定的條件反應加入碳酸鈉后，每隔10 min測定一次，以確定最佳反應時間。

1.3 分析方法的評價[10]

1.3.1 線性范圍的確定

以沒食子酸為標準品，配制質量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的沒食子酸工作液。以蒸餾水為空白對照，按確定的條件進行測定，以765 nm吸光度為Y軸，以沒食子酸濃度為X軸，繪制標準曲線，確定線性范圍。

1.3.2 方法重復性評價

取5份甘薯樣品，以最佳的乙醇濃度進行多酚提取，按確定的最佳條件測定765 nm吸光度，計算相對標準偏差，以確定實驗的重復性。

1.3.3 顯色液穩定性評價

以確定的最佳乙醇濃度對甘薯塊根多酚進行提取，在確定的最佳條件下測定，反應60 min后，在2 h內每隔30 min測定一次吸光度，計算其相對標準偏差，以確定顯色液穩定性。

1.3.4 加標回收實驗[28]

分別取3份已知多酚含量的甘薯塊根樣品各1.00 g，分別加入200 μg沒食子酸標準品，按上述確定的最佳條件測定多酚含量，計算沒食子酸標品回收率和相對標準偏差，評價方法的可靠性。

1.3.5 準確性評價

選取10份甘薯樣品，同時按GB/T 8313—2008[25]和優化的方法進行甘薯多酚含量測定，比較優化方法與GB/T 8313—2008方法的差異。

1.4 83份甘薯種質多酚含量測定

由于所測甘薯樣品較多，為保證樣品測定條件一致，首先將所有甘薯樣品統一進行預處理，具體做法為：

每個甘薯品種取大小均勻的3個薯塊，洗凈，晾干，去皮，采用四分法取樣，擦絲，粉碎機打碎，分別稱取1.00 g，加70%乙醇溶液2 mL研磨均勻，轉入10 mL離心管中，用2 mL 70%乙醇溶液沖洗研缽2次，沖洗液均轉入離心管中，-20 ℃保存。

1.5 數據處理

應用SPSS21.0及Excel 2010軟件對實驗結果數據進行分析整理，實驗結果所得的數據表示為平均值±SD。

2 結果與分析

2.1 最佳提取溶劑濃度的確定

通過設置不同的提取溶劑濃度，對各濃度下的提取效果進行評價，確定最佳的提取溶劑濃度，其結果見圖1。

圖1 提取和顯色反應條件實驗結果

由圖1可以看出，提取溶劑乙醇體積分數在40%～90%范圍內，隨著提取溶劑乙醇濃度的提高，吸光度逐漸增加，到達70%時，吸光度值取得最大值，繼續增加乙醇濃度則吸光度降低，表明用70%乙醇提取甘薯塊根多酚效果最佳。

2.2 碳酸鈉溶液濃度的確定

福林酚試劑與酚類化合物反應后在堿性條件下才可顯色，碳酸鈉溶液則為反應體系提供堿性環境，其含量影響著顯色反應效果。通過設置不同的碳酸鈉濃度，根據顯色效果確定最佳碳酸鈉濃度，結果如圖1所示。當碳酸鈉溶液質量分數為5%時，765 nm處的吸光度最大，因此確定碳酸鈉溶液質量分數最佳為5%。

2.3 福林酚溶液濃度的確定

通過設置不同的福林酚溶液濃度，比較各濃度下的吸光度值，從而確定最佳的福林酚濃度，結果如圖1所示。以70%乙醇進行甘薯塊根多酚的提取，提取液中加入不同濃度的福林酚溶液，再加入確定的最優濃度碳酸鈉溶液，進行測定，由圖1可以看出，隨著福林酚溶液濃度的增加，吸光度不斷增加，在15%時，吸光度達到最大值，之后吸光度降低，表明福林酚的最適體積分數為15%。

2.4 最佳反應時間的確定

按上述優化的反應條件進行測定，每隔10 min測定一次吸光度，比較評價不同反應時間對甘薯塊根多酚含量測定的影響，結果見圖1。隨著反應時間的增加，吸光度不斷增大，到達60 min后趨于穩定，因此確定最優反應時間為60 min。

甘薯多酚測定的最佳反應條件為：樣液各200 μL，加入1 mL 15%福林酚試劑，搖勻，反應5 min，加入800 μL 5% 碳酸鈉溶液，搖勻，室溫下避光放置60 min，在96孔板中每孔加入330 μL，設定酶標儀參數，在765 nm波長測定吸光度。

2.5 分析方法的評價

2.5.1 線性范圍的確定

取不同濃度的沒食子酸工作液，以蒸餾水為空白對照，按確定的條件進行測定。以765 nm吸光度為Y軸(均減去空白對照值)，以不同沒食子酸濃度為X軸，繪制標準曲線。沒食子酸質量濃度在0～100 μg/mL范圍內線性良好，回歸線方程為Y=0.009 6X+0.019 7,R2= 0.997 2。

2.5.2 方法的重復性評價

取甘薯樣品5份，以最佳的乙醇濃度進行多酚提取，按優化后的條件對樣品進行福林酚法測定，5份樣品測定結果如表1所示： 相對標準偏差為1.57%，表明優化后的方法的重復性良好。

表1 重復性實驗結果

2.5.3 顯色液穩定性評價

以確定的最佳乙醇濃度對甘薯塊根多酚進行提取，采用優化后的條件進行測定，反應60 min后，在2 h內每隔30 min測定一次吸光度，測定結果如表2所示，相對標準偏差為0.81%，表明顯色液穩定性良好。

表2 顯色液穩定性結果

2.5.4 加標回收實驗

按上述優化后的條件進行加標回收實驗，結果如表3所示。

表3 加標回收實驗結果

由表3可知，平均加標回收率為98.4%，相對標準偏差為2.4%，表明該方法準確可靠，可用于甘薯多酚含量測定。

2.5.5 準確性評價

應用優化的多酚含量測定方法與國標法同時測定10份甘薯樣品多酚含量，評價新建方法的準確性，結果如表4所示。兩種方法測定甘薯多酚含量結果差異均不顯著，表明優化后的方法測定結果準確可靠，且具有高效、經濟的特點。

表4 優化法和國標法測定甘薯多酚含量結果

2.6 83份甘薯種質多酚含量測定

應用上述優化確定的方法，對本實驗室所保藏的83份甘薯種質資源進行多酚的提取及含量的測定，以篩選出多酚含量較高的品種，測定結果見表5。

由表5可以看出，所測定甘薯品種塊根中多酚含量范圍在0.22～2.00 mg/g鮮樣之間，其中多酚含量最高的為漯紫薯4號(2.00 mg/g鮮樣)，其次為徐紫薯8號、煙紫薯3號、臨薯15051、冀薯7-20、冀紫薯3號等；不同品種甘薯多酚含量差異較大，且紫肉品種中的多酚含量均高于其他薯肉品種。

進一步對所有甘薯樣品的測定結果進行分布頻率統計分析，結果見圖2。由圖2可以看出，多酚質量分數大于1.5 mg/g的1個，占總樣品量的1.20%，在1.0～1.5 mg/g之間的3個，占總樣品量的3.61%，在0.5～1.0 mg/g之間的17個，占總樣品量的20.48%，在0.4～0.5 mg/g之間的30個，占總樣品量的36.14%，在0.3～0.4 mg/g之間的30個，占總樣品量的36.14%，在0.2～0.3 mg/g之間的2個，占總樣品量的2.41%。

表5 83份甘薯種質多酚含量(鮮樣)

圖2 甘薯品種多酚含量頻率分布圖

3 討論

在甘薯多酚測定中，研究報道的樣品處理方式多采用干燥處理，如曬干、烘干、凍干等[10,29,30]，然而，不同的干燥方式均會對甘薯多酚含量造成一定的影響[31]，本研究直接選擇鮮樣進行多酚的提取與測定，降低了多酚損耗；另外在甘薯多酚含量批量檢測中，為防止甘薯樣品中多酚含量在存放期間發生變化，本研究在測定開始前對待測樣品進行統一預處理：加提取劑研磨后轉10 mL離心管于-20 ℃冰箱保存待測。

在提取溶劑的選擇方面，本研究參考前人研究結果[16,30-33]，選取乙醇作為提取溶劑，并對其濃度進行優化，通過設置濃度梯度實驗，確定乙醇體積分數在70%條件下提取效果較好。

目前，國內外關于甘薯多酚含量測定的報道相對較少，本研究選擇了應用較廣泛的福林酚比色法。由于酶標儀與分光光度計原理相似[19]，應用96孔板代替比色杯，操作簡單，適宜批量檢測，節約成本。本研究將福林酚比色法與酶標儀相結合，對試劑濃度和反應時間等測定關鍵條件進行優化集成，具有準確性高，重復性好，適宜批量測定等優點，且在檢測效率上，較國標法可提高約3倍。

應用本研究所建立的方法對樣品進行測定，結果發現不同甘薯品種間多酚含量差異較大：在0.22～2.00 mg/g鮮樣之間，張文婷等[31]也報道了甘薯薯塊鮮樣的多酚含量在0.44～2.16 mg/g之間，本研究所測含量中最高、最低含量均較低。可能與所測品種、生長地點以及測定方法條件不同有關。陸國權等[16]研究發現甘薯多酚含量的基因型差異和環境效應差異顯著。此外，本研究發現紫肉品種中的多酚含量高于其他品種甘薯，與唐忠厚等[30]和張文婷等[31,34]報道結果一致。在所測定品種中多酚含量最高的是漯紫薯4號(2.00 mg/g鮮樣)，因此可對其進行進一步的開發利用。

對于甘薯多酚含量的測定，本研究僅對設定的水平進行了單因素實驗，無法考察到未設定水平對實驗的影響，有必要進一步對各因子水平及其交互作用進行系統優化。此外，福林酚法測定的為總多酚含量，今后應進行更全面、更深入的研究確定甘薯多酚的具體組成成分，以期為甘薯多酚的進一步開發利用提供更全面的依據。

4 結論

本研究確定了甘薯多酚最佳提取溶劑乙醇的體積分數為70%，建立了福林酚法結合酶標儀高效測定甘薯多酚含量的方法，確定最佳測定條件為福林酚體積分數15%，碳酸鈉質量分數5%，反應時間60 min。本方法平均加標回收率為98.4%，相對標準偏差為2.4%。該方法準確性高，重復性好，可高效測定甘薯多酚的含量。對甘薯樣品進行測定，其多酚質量分數在0.22～2.00 mg/g鮮樣之間，其中紫肉品種甘薯多酚含量較其他品種甘薯的高，開展高多酚品種的培育時可將紫甘薯作為重點。