銀-硅藻土納米復合材料合成及抑制稻谷霉變研究

邢常瑞 孔志康 仲夢涵 汪 靜 李 彭 袁 建

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

稻谷是世界上超過半數居民的主糧，是我國最重要的糧食作物之一[1]。我國近年來的糧食產量已大幅領先于世界其他國家，2013年我國水稻總產量達20 360 t[2]。新收獲的糧食很大一部分需要進入糧倉儲藏，陳糧流轉進入流通市場。稻谷中的水分、脂肪酶及微生物的存在使得稻谷易于在不適儲藏條件下發生霉變，引起品質劣變，影響糧食品質和安全[3]。因此，探索和應用新的納米材料防止霉變，對提高儲糧安全，延緩劣變和降低損耗具有重要意義。

稻谷儲藏損失主要包括蟲蝕、霉變和陳化等引起質量的損失。稻谷收獲入倉后，群落演替，儲藏過程中主要存在青霉、曲霉和鐮刀菌等菌屬，特別是曲霉可在低水分活度條件下大量繁殖，引起糧食變質[4, 5]。一項稻谷儲藏損失統計表明，5年平均樣本霉變率為3.53%[6]。稻谷霉變產生真菌毒素可極大降低稻谷的經濟價值和食用價值。目前主要的稻谷防霉手段是通過入倉前的干燥滅菌和控制儲藏環境，降低入倉前的微生物數量，控制微生物繁殖速度，防止稻谷質量劣變及產生毒素[7, 8]。銀納米粒子具有良好的廣譜殺菌性，并且具有殺菌高效、無毒性、不產生耐藥性等優點，被廣泛應用于食品防腐、污水處理、醫療衛生等方面[9，10]。硅藻土具有毒性低、性質穩定、無殘留及低成本的特點，被廣泛應用于糧倉中害蟲防治[11]。有學者研究發現硅藻土與植物精油復合增強其殺蟲效果，與納米銀復合能夠殺滅水中99.999%大腸桿菌、細菌及酵母[12]。目前，將納米銀材料或者其復合物用于稻谷實際儲藏過程中防止真菌生長的案例不多，將其作為糧倉抑菌劑鮮有報道。

硅藻土已經廣泛應用于糧倉中殺滅害蟲，并且對糧食品質加工品質沒有影響。本研究針對稻谷儲藏過程中的防霉需求，合成一種Ag/PDDA-Diatomite納米復合材料，具有簡單、高效、安全、低成本的殺蟲滅菌效果。對合成的銀-硅藻土基本特性進行分析，測試其抑菌效果，探索應用該材料在稻谷儲藏過程中的實際效果，為大規模推廣應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳稻(淮陰5號)。硝酸銀、直鏈淀粉標準溶液，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JEM-200CX透射電子顯微鏡，TM3000掃描電子顯微鏡，JMWT12大米外觀品質檢測儀，7700x電感耦合等離子質譜儀。

1.3 方法

1.3.1 銀-硅藻土納米復合材料的合成

將0.14 g硝酸銀(99.9%)加入100 mL去離子水中，攪拌溶解后加入0.21 g氫氧化鈉沉淀硝酸銀溶液，過濾去掉上清液后得到Ag2O沉淀物并溶解于100 mL質量分數為0.4%的氨水中，形成銀氨絡合物溶液；將銀氨絡合物溶液2倍梯度稀釋后分別用氨水定容到100 mL，加入0.5 g葡萄糖，磁力攪拌30 min后，得到納米Ag溶液。

將1 g干燥的硅藻土粉末分散在150 mL的0.01%PDDA溶液中，振蕩2 h。然后使用S3孔隙率的燒結玻璃過濾器過濾PDDA-Diatomite，除去過量的PDDA，將PDDA-Diatomite用去離子水洗滌1 h，然后過濾。將1 g PDDA-Diatomite分別加入到100 mL不同濃度的納米Ag溶液中并振蕩2 h后，使用燒結玻璃過濾器過濾并用去離子水洗滌，合成物料比為85.0、42.5、21.25、10.63、5.3、2.65和1.33mg/g的Ag/PDDA-Diatomite，分別記為M-A、M-B、M-C、M-D、M-E、M-F、M-G。最后，將Ag/PDDA-Diatomite于80 ℃干燥2 h，并保存在干燥器中。

1.3.2 Ag/PDDA-Diatomite抑菌實驗

選用稻谷儲藏過程中常出現的產黃青霉、白曲霉、雪腐鐮刀菌和黃曲霉來測試材料的抑菌性能。將分離純化后的真菌分別接種至孟加拉紅培養基上，在(28±1) ℃下培養5 d，取適量的無菌水將孢子洗至無菌錐形瓶中，振蕩搖勻，用無菌紗布過濾除去菌絲體，4 000 r/min離心20 min后，用血球計數板計數，再用0.85%生理鹽水將孢子懸液的濃度調至105～106CFU/mL搖勻備用。

在96孔板中初步測定不同合成物料比的Ag/PDDA-Diatomite的抑菌性，觀察不同合成物料比的抑菌效果。稱取1 g納米復合材料溶于5 mL無菌水制備不同濃度的材料懸浮液；稱取1 g純硅藻土溶于5 mL無菌水，并進行2倍梯度連續稀釋7次，制備純硅藻土懸浮液，分別準備實驗組、空白組和對照組，于(28±1)℃下培養，每24 h觀察1次，實驗進行3次。

實驗組：100 μL馬鈴薯液體培養基，80 μL的不同濃度的納米復合材料懸浮液和20 μL孢子懸浮液。

空白組：180 μL馬鈴薯液體培養基和20 μL孢子懸浮液。

對照組：100 μL馬鈴薯液體培養基，80 μL的不同濃度的硅藻土懸浮液和20 μL孢子懸浮液。

1.3.3 稻谷模擬儲藏實驗

將稻谷分為4組，每組稱取1 000 g稻谷：第1組為空白組；第2組為對照組，添加800 mg硅藻土；第3組添加800 mg M-B；第4組添加800 mg M-C。混勻用塑封袋密封后，將這些稻谷放入相對應溫度的人工氣調箱中進行儲藏，儲藏溫度為30 ℃，相對濕度恒定為60%，儲藏時間為5個月，30 d為1個周期。

每個周期稱取25 g的稻谷放入盛有225 mL無菌水的均質袋中，再用均質器均質3 min(30 r/min)，制成1∶10的菌懸液，吸取1 mL菌懸液進行10倍梯度稀釋，制成4個稀釋度的樣品勻液，進行平板實驗，于(28±1)℃培養5 d，記錄菌落形態。觀察菌落的形態特征和生長趨勢，通過PCR擴增技術確定菌株種屬。每個周期取出一定量的稻谷進行質量指標測定。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 真菌測定

真菌形態通過電子顯微鏡進行觀察；真菌菌落總數參照GB 4789.15—2016測定真菌和酵母數量；真菌種類經DNA片段擴增后，通過陽性檢測來判定。

1.4.2 大米感官品質測定

稻谷分樣：參照GB/T 5494—2018對稻谷樣品進行分樣。

稻谷感官品質：參照GB/T 22504—2018測定。

1.4.3 大米化學品質測定

蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2016凱氏定氮法。直鏈淀粉含量測定參照GB/T 15683—2008基準方法來測定。游離脂肪酸值含量測定參照GB 5510—2011苯提取法。稻谷糊化特性測定參照GB/T 24852—2010快速粘度儀法測定。Ag+含量的測定參照GB 5009.268—2016方法進行檢測。

1.5 數據統計分析

每組實驗重復3次，采用Matlab統計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，通過Origin 8.5繪圖。

2 結果

2.1 銀硅藻土納米復合材料的合成和表征

2.1.1 電位分析

硅藻土因表面有大量的羥基而帶有負電荷，其電位為-(19.6±5.5)mV，而納米Ag的電位為-(24.7±3.4)mV，所以硅藻土和納米Ag無法相互結合。本實驗通過陽離子聚電解質PDDA對硅藻土基質進行改性，使硅藻土負表面電位變為正表面電位(26.3±6.4)mV。具有正電位的PDDA-Diatomite可與負電位納米Ag通過靜電相互作用結合，得到Ag/PDDA-Diatomite[13]。

2.1.2 SEM和TEM表征分析

圖1a表明，銀顆粒表面形貌較為規則，粒子的大小平均為30～40 nm，無聚集現象。圖1b是硅藻土的SEM圖，可以看到硅藻土有較大的表面積、表面光整，孔結構豐富。圖1c、圖1d和圖1e、圖1f分別是Ag/PDDA-Diatomite的TEM和SEM圖。可以看出硅藻土表面附著大量Ag納米粒子，分布均勻，沒有聚集現象。

注：a為Ag的TEM圖；b為硅藻土的SEM圖；c、d為Ag/PDDA-Diatomite的TEM圖；e、f為Ag/PDDA-Diatomite的SEM圖。圖1 Ag、硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的TEM和SEM圖

2.1.3 EDX元素分析

硅藻土的主要化學成分是SiO2，還含有少量金屬氧化物。由表1和圖2可知硅藻土含有C、O、Al、Si、Fe、Ag、Na、K這8種元素，其中Ag含量極少；圖2中出現明顯的Ag峰，說明在Ag/PDDA-Diatomite存在較多Ag。表1數據表明，納米復合材料中Ag的原子質量分數由原來的0.04%上升到2.17%，證明了納米Ag顆粒成功附著在硅藻土表面。

表1 硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite中各元素的原子質量分數

圖2 Ag、硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的EDX元素表征分析圖

2.1.4 X射線光電子能譜表征分析

硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的X射線光電子能譜(XPS)如圖3所示。Ag/PDDA-Diatomite的Ag3d吸收峰是非常尖銳的2個峰(362～380 eV)，而硅藻土的XPS中沒有Ag3d的2個峰，與EDX元素分析結果一致，Ag3d(368 eV)的出現，證明在PDDA-

圖3 硅藻土和Ag/PDDA-Diatomite的XPS圖(a) 和XPS Ag3d圖(b)

Diatomite表面修飾上納米Ag。從Ag/PDDA-Diatomite的Si2p(103 eV)、C1s(286 eV)和O1s(533 eV)證明硅藻土中依然存在，說明利用層層自組裝方法成功合成Ag/PDDA-Diatomite，并且沒有改變原有的化學鍵。

2.2 納米復合材料在培養基環境中對真菌的抑制效果研究

2.2.1 純硅藻土的抑菌效果

將經稀釋后質量濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25和3.13 mg/mL的硅藻土懸浮液添加在培養基中，培養96 h后，4種真菌的菌落形態、大小和顏色以及菌絲的致密程度與空白組沒有明顯的變化，因此添加硅藻土懸浮液與否，不會影響4種霉菌的生長狀態，即硅藻土沒有抑菌活性，無法抑制4種真菌的生長。

2.2.2 Ag/PDDA-Diatomite的抑菌效果評價

將具有不同物料比的納米復合材料(標記M-A、M-B、M-C、M-D、M-E、M-F和M-G)分別加入培養基中，經過96 h培養后，對不同真菌的抑制效果有所差異。

產黃青霉培養實驗結果表明，培養24 h時，在M-E、M-F、M-G和空白組中出現菌落，菌絲白色致密。培養48 h時，菌落逐漸擴大，空白組中菌落明顯大于實驗組。培養72 h時，M-C中已經出現稀疏的菌絲，而M-D、M-E、M-F、M-G和空白組中的菌落直徑進一步擴大，菌絲致密呈絨狀。

白曲霉培養實驗結果表明，培養24 h時，只在M-G和空白組中出現白色菌落，培養48 h時，在M-F、M-G和空白組中菌落大小無明顯差距，在M-D和M-E組有白色絨狀菌絲；培養72 h時，M-C組中出現稀疏的菌絲，而M-D、M-E、M-F、M-G和空白組中的菌落直徑進一步擴大。

雪腐鐮刀菌培養實驗結果表明，培養24 h時，雪腐鐮刀菌生長相對較慢，只在空白組出現很小的白色菌落，菌絲稀薄。培養48 h時，M-D、M-E、M-F、M-G和空白組中出現白色菌落，培養72 h時，菌落直徑沒有增加， M-C、M-D、M-E、M-F和M-G 5個實驗組中都出現了菌落。

黃曲霉培養實驗結果表明，培養24 h時，黃曲霉的生長速度相對最快，在M-D、M-E、M-F、M-G和空白組中出現黃色菌落，培養48～72 h時，黃曲霉的生長速度依然相對較快，M-C的孔壁四周開始生長菌落，另外4組實驗組(M-D、M-E、M-F、M-G)和空白組中的黃曲真菌落顏色變深。

4種真菌的培養結果見表2，隨著Ag/PDDA-Diatomite中銀含量越高，對真菌的抑制作用越強。M-A、M-B可強烈抑制產黃青霉、白曲霉、雪腐鐮刀菌和黃曲霉的生長，表2中不列出。M-C組結果表明，物料比為21.25 mg/g的Ag/PDDA-Diatomite只對產黃青霉、白曲霉有一定抑菌活性，對雪腐鐮刀菌和黃曲霉的抑制作用相對較弱。物料比為10.63 mg/g及以下時，其對4種真菌的抑制作用不明顯。綜合成本、安全性和抑菌效果考慮，選用M-B和M-C組材料進行實際儲藏實驗。

表2 Ag/PDDA-Diatomite對四種真菌生長的影響

2.3 納米復合材料在稻谷實際儲藏過程中對真菌的抑制效果研究

稻谷的平板真菌計數結果如圖4所示。空白組與對照組中真菌的增長速度快，增長趨勢相一致。M-B和M-C組的真菌數量明顯低于空白組與實驗組，且增長趨勢也明顯較緩；與添加M-C的稻谷相比，添加M-B的稻谷中菌落總數略低。

圖4 不同實驗組中稻谷中菌落總數的統計

在稻谷儲藏開始后，每月的取樣結果如圖5所示。在空白組與添加硅藻土對照組的培養基中有大量真菌，而M-C和M-B中菌落的種類和數量明顯少于空白組和對照組，但仍然存在2種菌落(圖4d中三角形內的菌落1和圓圈內的菌落2)。經過分離純化后，進行形態學鑒定，見圖5e和圖5f。菌落1分生孢子梗較光滑呈不對稱的帚狀枝，其分生孢子梗有分支，頂端不形成膨大的頂囊。菌落2小型分生孢子數量較多，形態多變，大型的分生孢子數量少于小型分生孢子。基因測序鑒定菌落1和菌落2分別與產黃青霉(登錄號：KF152942.1)、雪腐鐮刀菌(登錄號：LT841236.1)的基因相似性達到99%。

注：a 空白組；b 添加硅藻土組；c 添加M-C組；d 添加M-B組；e 菌落1形態學分析；f 菌落2形態學分析。圖5 真菌平板培養結果

2.4 稻谷儲藏過程中質量指標的變化

稻谷在儲藏期間水分含量是影響稻谷質量指標的重要因素。水分降低會讓稻谷在加工時更容易斷裂，產生碎米。水分含量過高則適于稻谷中真菌的生長，真菌的大量繁殖會造成稻谷表面出現粉質現象使大米的完整率下降。

由表3可知，隨著儲藏時間的變化，稻谷不完善粒率總體呈現緩慢上升趨勢，空白組的不完善粒率從2.23%增加到6.5%，添加Ag/PDDA-Diatomite稻谷的不完善粒率略低于同期空白組與對照組結果。稻谷在儲藏過程中碎米率總體呈現快速上升趨勢，空白組和對照組的碎米率由6%左右增加到21%，而添加Ag/PDDA-Diatomite的稻谷的碎米率略低于同期的空白組與對照組結果。4組稻谷整精米率下降了14%左右，添加Ag/PDDA-Diatomite實驗組的整精米率略高于對照組和空白組的稻谷。總體而言，添加材料組與空白組相比，在不完善粒率，碎米率和整精米率3個指標上并無顯著性差異。堊白是大米淀粉組織排列疏松而存在空氣而導致白色不透明的現象，形成的原因主要是由于稻谷的品種和生長環境相關。稻谷儲藏過程中，前期堊白度在6.7%左右，儲藏5個月后不超過7.67%。4組稻谷的堊白度隨著儲藏實踐延長沒有明顯的差異，表明添加材料對稻谷堊白無影響。

表3 稻谷儲藏過程中質量指標變化

2.5 稻谷儲藏過程中化學品質變化

稻谷儲藏期間化學品質變化見圖6。4組稻谷在儲藏期間，蛋白質質量分數沒有明顯的變化，均在7%～8%，4組稻谷蛋白質含量也無明顯差異。各組樣品直鏈淀粉含量呈平緩增加趨勢，空白組和添加硅藻土組的稻谷中直鏈淀粉質量分數從14.6%增加至18.9%；添加復合材料的2組稻谷的直鏈淀粉含量略低于空白組和對照組。4組稻谷在儲藏期間，游離脂肪酸值增長較快，從最初的8 mg/100 g左右增加到22 mg/100 g左右，測定結果無顯著性差異。儲藏期間，4組稻谷糊化特性發生規律性變化，崩解值隨著儲藏時間增加而顯著下降，添加納米復合材料的兩組稻谷的崩解值略高于空白組和對照組的稻谷。由此儲藏發霉的稻谷的淀粉結構發生了一定的變化，使得淀粉抗剪切能力下降，淀粉粒更易破裂。回生值在儲藏期間先上升后下降，峰值黏度隨儲藏時間增加而上升；4組稻谷的回生值和峰值黏度相互之間無顯著性差異。由于復合材料中存在銀離子，因此測定大米中Ag+含量可以監測銀的遷移和釋放。儲藏期間，添加M-C和M-B的2組稻谷的米糠中Ag+的含量出現輕微的增加，而空白組和對照組稻谷的米糠中Ag+的含量在儲藏過程保持穩定，測定結果表明4組稻谷中米糠和精米的Ag+含量都低于0.03 mg/kg，從這個結果可推斷出Ag納米粒子與硅藻土表面結合較為牢固。

3 討論

在整個儲藏期間，4組稻谷的菌落總數始終呈現上升的趨勢。在稻谷實際儲藏過程中，儲藏期的前2個月，空白組和對照組稻谷的菌落總數上升的速度比較緩慢，在第3、4個月時，菌落數上升的相對較快，這可能與真菌的區系演替有關，稻谷表面的真菌由田間型真菌向倉儲型真菌演變，而其中曲霉屬真菌是導致稻谷霉變的重要真菌之一。平板培養結果表明，銀硅藻土復合材料具有高效的抑菌效果。通

圖6 稻谷儲藏過程中化學品質變化

過PCR擴增技術確定產黃青霉和雪腐鐮刀菌在稻谷儲藏中受Ag/PDDA-Diatomite作用后還能少量存活，屬于高耐受真菌。整精米率是評判大米感官品質的重要質量指標，有研究表明，粳稻米的蒸煮食味品質與其粒形特征顯著相關，典型相關系數為0.764 3[14]。稻谷的多個指標，比如谷物顆粒大小、硬度、米糠層厚度、堊白度及蛋白含量都會對整精米率有一定影響。表3實驗結果表明Ag/PDDA-Diatomite可以減緩整精米率的下降速度。儲藏期間，4組稻谷的碎米率在第4個月時出現大幅度的上升，但在每個儲藏周期，添加納米復合材料的稻谷碎米率都低于對照組和空白組。這種情況可能是因為真菌的大量繁殖，大量干物質被消耗，并導致稻谷粉質和組織疏松，在加工時更易斷裂，增加碎米率，降低整精米率。納米銀復合材料具有的抑菌作用減少了的真菌數量，減緩稻谷品質劣變、降低碎米率。

稻米直鏈淀粉含量和變化會影響稻谷蒸煮品質，引起米飯硬度上升，黏度下降。一般認為，相比于 4 ℃儲藏，高溫儲藏會導致直鏈淀粉含量明顯增加。在實際儲藏過程中，直鏈淀粉增加可能是由于脫支酶活性高，將支鏈淀粉使其轉變為直鏈淀粉片段，添加Ag/PDDA-Diatomite的2組稻谷(M-C和M-B組)其直鏈淀粉增加量要顯著小于空白組和添加純硅藻土組，有可能是材料中的銀具有一定滅酶效果；也可能是由于空白組和對照組真菌大量生長繁殖導致稻谷本身溫度高于添加材料組(M-C和M-B組)，而導致脫支酶活性高。

Ag/PDDA-Diatomite的穩定性對其抗菌性能的長期保持具有重要意義。在稻谷儲藏過程中，添加M-B的2組稻谷的米糠中Ag含量在儲藏的第2個月開始，銀含量有少許增加現象，從0.016 mg/kg上升到0.026 mg/kg，說明添加的銀硅藻土材料中有少許的銀離子被黏附于稻殼上，在加工過程中遷移到米糠中。但總體來說米糠和精米粉中Ag的含量均小于0.03 mg/kg，米糠等副產物的加工利用未受到影響，大米食用安全品質也有保障。

4 結論

本研究驗證了Ag/PDDA-Diatomite對稻谷常見真菌的抑制作用。結果表明Ag/PDDA-Diatomite中銀離子含量越高，其對真菌的抑制效果越強。在培養基環境中，當物料比達到42.5 mg/g及以上時，能夠對白曲霉、產黃青霉、雪腐鐮刀菌和黃曲霉的生長產生強烈的抑制，同時真菌孢子也失去活性；Ag/PDDA-Diatomite可以實際應用于稻谷儲存，高效抑制稻谷霉變。另外，該材料對大米品質的維持有一定作用，納米Ag也不會影響大米食用安全性和副產物的加工利用。因此，銀硅藻土納米復合材料在稻谷倉儲中具有很好的推廣應用價值。