復方紫海膽黃油軟膠囊制備工藝的研究

潘 南，鄧玉鳳，徐清云，段義凡，周逢芳，鄭昇陽，劉智禹*

(1.福建省水產研究所，國家海水魚類加工技術研發分中心，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.寧德師范學院生命科學學院，福建 寧德 352100；3.廈門軟件職業技術學院軟件工程系，福建 廈門 361024)

紫海膽(Heliocidariscrassispina)屬棘皮動物門、海膽綱、拱齒目、長海膽科，廣泛分布于中國東海、南海以及日本沿海海域[1]。其性腺，又稱紫海膽黃，富含脂質、游離脂肪酸及脂溶性微量活性物質等，有益于維持人類肌體健康穩態[2-3]。然而由于富含共軛、非共軛不飽和鍵，在高溫、高濕、光照、酶、金屬、微生物等催化條件下，紫海膽黃脂質容易發生氧化、降解、異構等反應，導致其品質惡化及生物活性物質的損失等[4-5]。因此，紫海膽黃脂質的加工、保藏以及產品研發成為生產企業和科研人員亟待解決的難題。

膠囊劑是一種將藥物(或加輔料)填充于空心硬質膠囊或密封于軟質囊殼中的固體制劑，具有提高藥物穩定性、掩蓋藥物不良氣味、延緩或靶向釋放、攜帶方便以及服用安全等特點[6]。在油脂產品開發中，通過膠囊劑包裹油滴，阻止油脂與光、熱、氧氣等接觸，以保持油脂品質、營養價值和功能。目前，軟膠囊劑型的商業化海洋膳食脂質，如魚油、鱈魚魚肝油、三文魚油、金槍魚油、海豹油等，分別在份額與價值方面引領功能性膳食營養補充劑市場[7]，世界經濟合作與發展組織/聯合國糧農組織(OECD-FAO)預期該比例仍將持續增長[8]。

為促進海洋膳食脂質的研發，本研究以水酶法提取、脫膠、堿煉、減壓蒸餾的福建紫海膽黃油為原料，小麥胚芽油為分散劑，天然維生素E為抗氧化劑，以流動性、均勻性、沉降系數和成本系數為指標，優化復方紫海膽黃油軟膠囊內容物配方；以甘油為增塑劑、PEG400為稀釋劑、尼泊金乙酯為防腐劑，采用單因素法和正交試驗設計法，以膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限為指標，確定囊壁優化配方；按上述配方，采用旋轉壓制法等工藝制備復方紫海膽黃油軟膠囊，以水分、裝量差異、崩解時限和微生物限度規定為指標，對復方紫海膽黃油軟膠囊進行質量評價，以期提供一種符合《中華人民共和國藥典2015年版》通則0103“膠囊劑”規定的海洋膳食脂質軟膠囊優化配方及其制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫海膽黃粉：鮮活紫海膽采集于福建省泉州市永寧鎮近海海域，保活運輸至福建省水產研究所，開殼取其性腺，漂洗、瀝干水分，-20℃保存。然后經真空冷凍干燥，粉碎、過40目篩、真空密封，-20℃保藏。

明膠(藥用輔料級別、凍力180)，購于羅賽洛(廣東)明膠有限公司；甘油(藥用輔料級別)，購于印尼春金集團；尼泊金乙酯(藥用輔料級別)，購于國藥集團化學試劑有限公司；液狀石蠟(藥用輔料級別)，購于成都華邑藥用輔料制造有限責任公司。以上藥用輔料均符合《中華人民共和國藥典2015年版二部》標準。

中性蛋白酶(5×104U/g)，購于南寧龐博生物工程有限公司；天然維生素E，購于浙江綠州生物技術有限公司；小麥胚芽油，購于河北家豐植物油有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、正己烷、氯化鈉、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等(均為分析純)，購于國藥集團化學試劑有限公司；聚山梨酯80，購于國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶(5 000 U/g)、聚乙二醇400(PEG400)，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)，購于青島科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

JLR系列50型軟膠囊機、真空溶膠罐及空壓機，北京中天精藍科技有限公司；冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠有限公司；BSA8201電子天平，賽多利斯(上海)貿易有限公司；FE28-Standard pH計，瑞士梅特勒-托利多國際有限公司；HH-6型數顯電子恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；R-1001VN旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；5810R冷凍型臺式大容量高速離心機，德國艾本德(中國)有限公司；JKI-BJ-II型崩解時限儀，上海精學科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫海膽黃油制備

稱取紫海膽黃粉，料液比1∶20(m/V，g/mL)、酶添加量7 500 U/g、50℃和pH 7.0的條件下酶解5 h。沸水浴滅酶10 min，按終濃度比例，分別加入25%氯化鈉(m/V)、65%無水乙醇(V/V)，加入0.1倍體積的正己烷，靜置過夜[9]。收集正己烷油相，35℃減壓濃縮，獲得紫海膽黃粗油。加入85%磷酸(V/V)使其在紫海膽黃粗油的終濃度達到1%(V/V)、60℃水浴20 min，離心后收集上層清油。加入1 mol/L NaOH、65℃水浴20 min，加入0.1倍體積的去離子水，離心后收集上層清油[10]。將其100℃減壓蒸餾1 h，獲得紫海膽黃精煉油。

1.3.2 內容物配方篩選

以小麥胚芽油為分散劑、天然維生素E為抗氧化劑，設計不同質量比例的復方紫海膽黃油軟膠囊內容物配方(表1)。分別稱取紫海膽黃油與小麥胚芽油，40℃水浴10 min。根據表1制備不同處方的內容物，攪拌均勻，室溫冷卻。以流動性(25%)、均勻性(25%)、沉降系數(25%)和成本系數(25%)為指標，同一樣本各指標比分值乘以換算系數的總和為該樣本的綜合評分，篩選最優內容物配方[11]。各指標的測定和計算如下：

1)流動性。使用藥匙移取適量內容物，與水平面成45°角，觀察內容物從藥匙滴落的情況，以10分制計，分值越高，流動性越好。

2)均勻性。依據有無結塊或氣泡判斷內容物的分散均勻性，以10分制計，分值越高，均勻性越好。

3)沉降系數。移取適量內容物至具塞離心管，測量內容物的初始高度H0；將具塞離心管置于25℃水浴、靜置24 h，測量內容物沉降面的高度H1；根據公式計算沉降系數F，F值越接近1，內容物越穩定。

(1)

4)成本系數。設定紫海膽黃精煉油、小麥胚芽油、天然維生素E的成本價格分別為3 000元/500 g、200元/500 g和100元/500 g，計算不同配方內容物的成本V0，以僅含紫海膽黃精煉油為內容物配方的成本為V1，根據公式計算成本系數V，V值越小，成本越少。

(2)

表 1 不同質量比例的內容物配方設計

1.3.3 囊壁配方篩選

1)囊壁制備工藝，稱取適量明膠，按一定比例加水浸泡膨脹，依次加入增塑劑甘油、稀釋劑PEG400和2.5‰防腐劑尼泊金乙酯，75℃水浴、攪拌1 h，超聲10 min排氣。將膠液均勻倒入培養皿，制備厚度2 mm的膠皮，室溫冷卻，劃成2 cm×2 cm的小塊膠皮[12]。

2)崩解時限測定，參照《中華人民共和國藥典2015年版三部》通則“崩解時限檢查法”[13]，采用升降式崩解儀檢查膠皮的崩解時限。分別取6塊2 cm×2 cm膠皮置于吊籃不銹鋼管中，將不銹鋼管固定于支架上，浸入盛有人工胃液、溫度為(37±1)℃的燒杯中，開啟機子，測定膠皮全部崩解并通過篩網的時間。

3)單因素試驗，明膠∶甘油∶PEG400∶尼泊金乙酯=1∶0.3∶0.05∶0.002 5，以膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限為指標，測定不同質量比例水(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2)對囊壁的影響。

明膠∶水∶PEG400∶尼泊金乙酯=1∶1∶0.05∶

0.002 5，以膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限為指標，測定不同質量比例甘油(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8)對囊壁的影響。

明膠∶水∶甘油∶尼泊金乙酯=1∶1∶0.3∶

0.002 5，以膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限為指標，測定不同質量比例PEG400(0、0.025、0.050、0.075、0.100)對囊壁的影響。

4)正交試驗設計，基于單因素試驗結果，選取水、甘油與PEG400進行正交優化試驗設計，各因素水平見表2。以膠皮崩解時限為指標進行評分，評分標準：2.31～3.00 min為100～91分，3.01～3.30 min為90～81分，3.31～4.00 min為80～71分，4.01～4.30 min為70～61分[14]。

表2 正交試驗因素水平表

1.3.4 軟膠囊制備工藝

1)生產工藝流程圖

2)滅菌。生產前檢查儀器、設備是否齊全，對生產車間、溶膠罐、輸膠管、進出料管口、膠盒、噴體與轉籠等設備進行滅菌。

3)內容物配制。根據“1.3.2”篩選的最優處方及工藝，配制復方紫海膽黃油內容物，臨生產前將內容物倒入料斗中待用。

4)膠液配制。根據“1.3.3”篩選的最優處方及工藝，稱取水、甘油、PEG400和2.5‰尼泊金乙酯加入化膠桶，緩慢升溫至85℃，加入明膠，攪拌1 h，60℃保溫過夜備用。

5)旋轉壓制法制丸。環境溫度16～18℃、相對濕度≤50%，分別預熱膠盒溫度至50℃、噴體溫度至40℃，開啟空壓機，將保溫桶中膠液通過輸膠管壓至膠盒內；開啟鼓風機，通過調節油軸和滾輪之間間隙，調整膠皮厚度至0.9 mm，在滾輪上展布制成連續的膠帶；內容物通過供料系統流經灌裝泵，噴頭注料填充入膠帶，經滾模旋轉壓制成軟膠囊，調節灌裝泵使裝量符合規定。

6)定型。開啟轉籠與鼓風機，將制備好的軟膠囊轉移至轉籠，溫度35℃、相對濕度30%，旋轉干燥4 h。

7)選丸與洗丸。將定型后的軟膠囊進行燈檢，去除異形、黏連、漏油等不合格軟膠囊，使用醫用紗布擦拭軟膠囊。

8)二級干燥。將軟膠囊平鋪至晾干盤中，環境溫度(30±2)℃、相對濕度35%，干燥18～24 h。

1.3.5 軟膠囊質量評價

1)水分。參照《中華人民共和國藥典2015年版三部》通則0832“水分測定法 第二法(烘干法)”測定[13]。

2)裝量差異。參照《中華人民共和國藥典2015年版三部》通則0103“膠囊劑 裝量差異(檢查法)”測定[13]。

3)崩解時限。參照《中華人民共和國藥典2015年版三部》通則0921“崩解時限檢查法”測定[13]。

4)微生物限度。參照《中華人民共和國藥典2015年版三部》通則1105“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”測定[13]。

1.4 數據處理

試驗數據以平均值±標準差(ˉx±SD)表示，采用SPSS 22.0統計分析軟件對數據進行處理，使用Duncan法進行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 內容物優化配方

小麥胚芽油是一種營養健康的膳食油脂，其不飽和脂肪酸含量約80%、亞油酸含量≥50%、維生素E含量遠高于其他植物油[15]，因此，研究選取小麥胚芽油作為紫海膽黃油的分散劑。油類混合液中常添加油溶性抗氧化劑，如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基對甲苯酚(BHT)、乙氧基喹啉、沒食子酸酯、特丁基對苯二酚(TBHQ)和培酸丙酯等[4]。研究選取天然維生素E作為抗氧化劑，以抑制富含不飽和脂肪酸的紫海膽黃油的氧化和聚合。

以水酶法提取、脫膠、堿煉、減壓蒸餾的福建紫海膽黃精煉油為原料，小麥胚芽油為分散劑，天然維生素E為抗氧化劑，分別以流動性、均勻性、沉降系數與成本為指標，探討了不同復方紫海膽黃油配方對內容物的影響。由表3可知，配方1～3的綜合評分呈遞增趨勢，配方4～7呈遞減趨勢，其中，配方3(紫海膽黃油∶小麥胚芽油∶天然維生素E=3∶6∶1)的綜合評分最高，因此，選取配方3作為復方紫海膽黃油軟膠囊內容物的最優配方。

表 3 不同配方對軟膠囊內容物的影響

2.2 膠皮優化的配方

2.2.1 單因素試驗

1)水含量對膠皮的影響，明膠∶甘油∶

PEG400∶尼泊金乙酯=1∶0.3∶0.05∶0.002 5，以膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限為指標，測定不同質量比例水(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2)對囊壁的影響(表4)。隨著水的比例增大，膠液黏稠度下降、膠皮由硬變軟、崩解時限減少。經方差分析，當水的質量比≥1.1時，膠皮崩解時限無顯著性變化。

表 4 水含量對囊壁的影響

2)甘油含量對膠皮的影響，明膠∶水∶

PEG400∶尼泊金乙酯=1∶1∶0.05∶0.002 5，以膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限為指標，測定不同質量比例甘油(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8)對囊壁的影響，結果見表5。由表5可知，隨著甘油比例的增大，膠液黏稠度隨之增大、膠皮硬度隨之增大、膠皮崩解時限隨之減少。經方差分析，不同甘油質量比對膠皮崩解時限組間的影響具有顯著性差異。其中，當甘油質量比例為0.5和0.6時，膠液黏稠度適中、膠皮硬度適中、崩解時限在3.16～3.33 min之間，具有較好的工藝操作性。

表 5 甘油含量對囊壁的影響

3)PEG400含量對膠皮的影響，明膠∶水∶甘油∶尼泊金乙酯=1∶1∶0.3∶0.002 5，表6為不同質量比例PEG400(0、0.025、0.050、0.075、0.100)對膠液黏稠度、膠皮軟硬程度和崩解時限的影響。由表6可知，隨著PEG400含量的增多，膠液黏稠度減少、膠皮變硬、崩解時限減少。經方差分析，當PEG400的質量比為0.050～0.075時，膠皮崩解時限沒有顯著性差異。

表 6 PEG400含量對囊壁的影響

2.2.2 正交優化試驗

基于單因素試驗結果，分別選取水、甘油和PEG400為試驗因素，設計L9(34)正交水平表(表2)，以膠皮崩解時限為指標，篩選囊壁最優配方，正交試驗設計結果見表7、正交試驗方差分析見表8。

由表7可知，不同因素對膠皮崩解時限的影響程度依次為甘油(B)>水(A)>PEG400(C)。通過極差分析可知，當明膠質量比為1、尼泊金乙酯質量比為0.002 5時，囊壁配方的優化組合為B3A3C1，即明膠∶水∶甘油∶PEG400∶尼泊金乙酯=1∶1.1∶0.6∶0.05∶0.002 5，在此條件下膠皮崩解時限為(2.44±0.07)min。如表8的方差分析所示，甘油含量對膠皮崩解時限的影響極顯著，水含量對膠皮崩解時限的影響顯著。

表 7 正交試驗設計及結果

續表7

表 8 正交試驗方差分析

2.3 復方紫海膽黃油軟膠囊的生產

根據“1.3.4”工藝流程進行復方紫海膽黃油軟膠囊的制備，采用“2.1”篩選的內容物最優配方紫海膽黃油∶小麥胚芽油∶天然維生素E=3∶6∶1，以及“2.2”篩選的膠皮最優配方明膠∶水∶甘油∶PEG400∶尼泊金乙酯=1∶1.1∶0.6∶0.05∶0.002 5，經化膠、制膠，壓丸、定型、選丸、洗丸、干燥、檢驗、包裝等工序，獲得復方紫海膽黃油軟膠囊(圖2)，該產品質量穩定，其工藝操作簡單、安全高效，為進一步中試生產放大提供了技術參考。

2.4 復方紫海膽黃油的質量評價

2.4.1 水分

測得復方紫海膽黃油軟膠囊水分含量為(0.20±0.02)%，符合《中華人民共和國藥典2015年版》0103“膠囊劑 水分”的規定(不得超過9.0%)。

2.4.2 裝量差異

隨機抽取復方紫海膽黃油軟膠囊，測得樣品軟膠囊的重量、囊殼重量和內容物重量，計算獲得裝量差異。由表9可知，所測軟膠囊的裝量差異均符合《中華人民共和國藥典2015年版》規定(平均裝量或標示裝量在 0.30 g以下的裝量差異限度為±10%)。

表9 復方紫海膽黃油軟膠囊裝量差異

表10 復方紫海膽黃油軟膠囊微生物限度

2.4.3 崩解時限

測得復方紫海膽黃油軟膠囊崩解時限為(11.31±0.25) min，符合《中華人民共和國藥典2015年版》規定(1 h內全部崩解)。

2.4.4 微生物限度

測得復方紫海膽黃油軟膠囊的微生物限度，如表10所示，均符合《中華人民共和國藥典2015年版》規定。

3 結論

油脂中長鏈不飽和脂肪酸、脂溶性成分等功能活性因子極易在高溫、高濕、光照、酶、金屬、微生物等催化條件下被氧化。軟膠囊制劑具有提高油脂穩定性、掩蓋不良氣味、使液態脂質固體化和定點定位緩釋等其他劑型難以比擬的優點，因此，研究以紫海膽黃油為對象，開展了復方紫海膽黃油軟膠囊制備工藝優化，獲得軟膠囊內容物優化處方為紫海膽黃油∶小麥胚芽油∶天然維生素E=3∶6∶1、 囊壁優化處方為明膠∶水∶甘油∶PEG400： 尼泊金乙酯=1∶1.1∶0.6∶0.05∶0.002 5。進一步采用軟膠囊機經旋轉壓制，獲得復方紫海膽黃油軟膠囊產品，其水分、裝量差異、崩解時限和微生物限度均符合《中華人民共和國藥典2015年版》相關規定。本研究提供了一種復方紫海膽黃油軟膠囊優化配方及其制備工藝，為進一步開展中試放大生產提供了數據支持，為我國膳食脂質的功能活性應用及產業健康發展提供了技術參考。