三種苦參堿制劑對非靶標生物的毒性研究

吳 遲，孫 田，何明遠，蔣紅云，張 蘭，張燕寧，毛連綱，朱麗珍，鄭永權，劉新剛*

（1.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2.廣西思浦林科技有限公司，南寧 530001）

我國是農業大國，農藥在生產生活中發揮著非常重要的作用[1]。近年來，隨著環保意識的提高和可持續發展的需要，生物農藥受到了廣泛關注。2020年2月，農業農村部印發的《2020年種植業工作要點》中就包括完善農藥登記審批“綠色通道”政策。該政策為生物農藥的登記創造了良好的環境[2]，也為生物農藥的發展創造了有利的條件。植物源農藥歷史悠久，具有種類多、作用方式特異、不易產生抗藥性、對環境友好等特點[3]，成為生物農藥的首選之一。

目前，苦參堿是登記數量最多的植物源農藥。根據中國農藥信息網[4]，截至2020年10月，獲得登記許可且在有效期內的苦參堿農藥品種共121個。苦參堿是一種從苦參和苦豆子等植物中提取出的生物堿，具有殺蟲、殺螨、殺菌等生物活性[5-7]，在農業領域被廣泛關注和應用。目前，關于苦參堿的防控作用國內外均有報道，如苦參堿可用于防控茶尺蠖[8]；對黑腹果蠅成蟲具有殺蟲活性[9]；能夠有效控制棉蚜種群數量[10]；對白蟻具有強烈的拒食作用[11]；對枸杞刺皮癭螨可達到較好的的防效，且對天敵安全性較高[12]；對蘋果樹腐爛病防效優異[13]等。

關于苦參堿對環境安全性的研究也有相關報道。豆敏詳等[14]研究表明，苦參堿原藥對非靶標生物鵪鶉、意大利蜜蜂、家蠶和斑馬魚等均為低毒。然而，在苦參堿加工生產過程中，一般會添加助劑以制成不同劑型，便于田間使用。然而，部分農藥助劑中含有多種有害化學品[15]，如有機硅對大型溞的存活、生長和繁殖等都有一定程度的影響，并且是對成年蜜蜂毒性最大的助劑之一[16-17]；壬基酚聚氧乙烯醚可導致斑馬魚胚胎死亡、胚胎畸形，以及限制斑馬魚的生長等[18]。目前，在我國，苦參堿主要登記劑型為可溶液劑、水劑和可濕性粉劑等，但關于苦參堿制劑對生態系統中的非靶標生物的毒性效應研究較少。因此，本研究主要依據GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》標準[19]、美國國家環境保護局（EPA）和經濟合作與發展組織（OECD）準則[20-24]，分別測定了3種苦參堿制劑對以下非靶標生物——日本鵪鶉（Coturnix japonica）、意大利蜜蜂（Apis melliferaL.）、家蠶（Bombyx moriL.）、斑馬魚（Danio rerio）和大型溞（Daphnia magna）的急性毒性效應，以確定農藥助劑是否影響苦參堿對非靶標生物的毒性，并為苦參堿制劑在田間合理使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試農藥。0.6%苦參堿可溶液劑，山東拜沃生物技術有限公司；0.5%苦參堿水劑，江西豐源生物高科有限公司；0.3%苦參堿可濕性粉劑，煙臺綠云生物科技有限公司；95.0%苦參堿標準品，北京勤誠亦信科技開發有限公司。

供試生物。日本鵪鶉：選用同批孵化出殼的鵪鶉，試驗用鳥為30日齡，平均體重為97.2 g；意大利蜜蜂：選擇健康無病、大小一致的成年工蜂用于試驗；家蠶：品種為“九芙×七湘”，試驗用蠶為二齡起蠶；斑馬魚：平均全長為1.92 cm，平均體重為0.065 0 g；大型溞：處于孤雌生殖狀態，未出現雄溞和冬卵，試驗用溞為培養3代以上、出生24 h以內的非頭胎溞。

供試生物的品系和來源如表1所示。依據GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》[19]開展的意大利蜜蜂、家蠶、斑馬魚和大型溞參比物質試驗結果見表2，其毒性端點值和95%置信限均在可接受范圍內，表明試驗體系和供試生物有效可靠，可用于急性毒性試驗。

表1 供試生物信息

表2 參比物質試驗結果

儀器設備。分析天平、半微量天平、便攜式pH計、便攜式溶解氧測定儀、便攜式溶解氧測定儀，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；水質硬度計，上海三信儀表廠；島津LC-20AT高效液相色譜儀、InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），島津企業管理（中國）有限公司；旋轉蒸發儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；多管漩渦混合器，常州杰博森儀器有限公司；智能人工氣候箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；不銹鋼鳥籠（60 cm×50 cm×40 cm）。

1.2 試驗方法

本研究根據GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》[19]、EPA和OECD系列準則（No.213、No.214、No.203、No.202）[20-24]，進行供試農藥對非靶標生物的毒性效應研究，并建立分析方法對水生生物試驗溶液進行真實濃度檢測。

1.2.1 非靶標生物毒性試驗

鳥類急性經口毒性試驗。采用直接灌喂供試農藥的方式進行經口染毒。將0.6%苦參堿可溶液劑設置成濃度為25.0、30.8、37.8、46.5和57.2 mg a.i./kg·bw 5個試驗處理；0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑受樣品含量限制，分別設置了上限濃度為51.0 mg a.i./kg·bw和12.4 mg a.i./kg·bw試驗處理，同時設置空白對照組。每個處理為10只鵪鶉（雌雄各半）。染毒后8 h以及隨后連續7 d觀察鵪鶉的中毒癥狀與死亡情況，并計算7 d-LD50（半致死劑量）。

蜜蜂急性毒性試驗。急性經口毒性：用50%蔗糖水配制試驗溶液，將0.6%苦參堿可溶液劑設置成濃度為24.9、29.9、35.9、43.1、51.7和62.0μg a.i./蜂6個試驗處理；0.5%苦參堿水劑設置成濃度為3.12、6.25、12.50、25.00和50.00μg a.i./蜂5個試驗處理；將0.3%苦參堿可濕性粉設置成濃度為0.625、1.250、2.500、5.000和10.000μg a.i./蜂5個試驗處理，同時設置空白對照組。每處理3個重復，每重復10只蜜蜂。取200μL上述試驗溶液供蜜蜂取食，根據取食量計算實際染毒劑量，于染毒后24和48 h觀察記錄蜜蜂的中毒癥狀和死亡數，并計算48 h-LD50。急性接觸毒性：采用0.6%苦參堿可溶液劑和0.5%苦參堿水劑直接染毒。取2.00μL供試農藥點于麻醉后蜜蜂的中胸背板處，得到染毒濃度分別為12.1和10.2μg a.i./蜂的試驗處理；0.3%苦參堿可濕性粉受劑型限制，設置上限染毒濃度為0.90μg a.i./蜂試驗處理，同時設置空白對照組。每處理3個重復，每重復10只蜜蜂，于染毒后24和48 h觀察記錄蜜蜂的中毒癥狀和死亡數，并計算48 h-LD50。

家蠶急性毒性試驗。采用浸葉法進行染毒。將0.6%苦參堿可溶液劑設置成濃度為10.0、16.4、26.9、44.1、72.3、119.0和195.0 mg a.i./L 7個試驗處理；將0.5%苦參堿水劑設置成濃度為2.00×103mg a.i./L試驗處理；將0.3%苦參堿可濕性粉劑設置成濃度為0.500、0.825、1.360、2.250、3.710、6.110和10.100 mg a.i./L 7個試驗處理，同時設置空白對照組。每處理3個重復，每重復20頭家蠶。用50 mL試驗溶液浸漬約5 g桑葉，使藥液均勻分布在葉面上，取出陰干后，用于家蠶飼喂染毒，于染毒后24、48、72和96 h觀察記錄家蠶的中毒癥狀及死亡情況，并計算96 h-LC50（半致死濃度）。

魚類急性毒性試驗。采用靜態法進行染毒，試驗期間不更換試驗溶液。將0.6%苦參堿可溶液劑設置成濃度為1.00、1.24、1.54、1.91、2.36和2.93 mg a.i./L 6個試驗處理；將0.5%苦參堿水劑設置成濃度為0.100、0.132、0.174、0.230、0.304和0.401 mg a.i./L 6個試驗處理；將0.3%苦參堿可濕性粉劑設置成濃度為0.065 0、0.085 2、0.112 0、0.146 0、0.191 0和0.251 0 mg a.i./L 6個試驗處理；同時設置空白對照組。每個處理為7尾魚，于染毒后6、24、48、72和96 h觀察和記錄斑馬魚的中毒癥狀及死亡情況，并計算96 h-LC50。

溞類急性活動抑制試驗。采用靜態法進行染毒，試驗期間不更換試驗溶液。將0.6%苦參堿可溶液劑設置成濃度為1.00、1.58、2.50、3.94、6.23和9.85 mg a.i./L 6個試驗處理；將0.5%苦參堿水劑設置成濃度為1.05、1.61、2.46、3.76、5.75和8.80 mg a.i./L 6個試驗處理；將0.3%苦參堿可濕性粉劑設置成濃度為0.020 0、0.027 6、0.038 1、0.052 6、0.072 5和0.100 0 mg a.i./L 6個試驗處理，同時設置空白對照組。每處理4個重復，每重復5只溞，于染毒后24和48 h觀察記錄大型溞的中毒癥狀及受抑制情況，并計算48 h-EC50（半抑制濃度）。

1.2.2 儀器條件分析方法建立

采用島津LC-20AT高效液相色譜儀對苦參堿進行真實濃度檢測。色譜條件：色譜柱為InertSustain C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；進樣體積為20μL；柱溫箱為40℃；流動相為乙腈與0.02%三乙胺水溶液（40.0∶60.0，V/V），流速為1.000 mL/min；檢測器為PDA二極管陣列檢測器；檢測波長為200 nm；保留時間為4.04 min。

前處理方法。采集10.000 mL供試水樣于離心管中，加入10.000 mL乙酸乙酯漩渦振蕩萃取。加入適量的氯化鈉再次振蕩萃取，靜置分層。轉移上層有機相至旋蒸瓶中，重復提取1次。合并有機相，旋蒸至干。吸取1.000 mL乙腈（色譜純）至旋蒸瓶中，洗滌內壁，過0.22μm濾膜，上機檢測。

水樣檢測。分別在魚類急性毒性試驗和溞類急性活動抑制試驗開始和結束時采集試驗溶液，并對苦參堿進行真實濃度檢測。

1.3 數據分析與毒性等級劃分

采用統計軟件SPSS 25.0概率回歸分析計算毒性端點值，并根據GB/T 21270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》判斷供試農藥對不同非靶標生物的毒性等級。

2 結果與分析

2.1 3種苦參堿制劑對供試生物的急性毒性效應

試驗期間，對照組供試生物無死亡或受抑制情況，且未出現任何中毒癥狀。在日本鵪鶉急性毒性試驗中，用0.6%苦參堿可溶液劑處理的日本鵪鶉出現閉眼打盹的癥狀；在0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑的試驗處理組中，日本鵪鶉表現正常，未出現任何癥狀。在蜜蜂急性經口毒性試驗中，用0.6%苦參堿可溶液劑處理的蜜蜂出現失去平衡、行動緩慢、身體蜷縮、雙翅張開的癥狀；在0.5%苦參堿水劑試驗處理組中，蜜蜂表現正常，無不良癥狀；在0.3%苦參堿可濕性粉劑的試驗處理組中，蜜蜂出現身體蜷縮和雙翅張開的癥狀。在蜜蜂急性接觸試驗中，用3種苦參堿制劑處理的蜜蜂均無不良癥狀。在家蠶急性毒性試驗中，用0.6%苦參堿可溶液劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑處理的家蠶均出現吐液現象；0.5%苦參堿水劑未對家蠶造成不良影響。在魚類急性毒性試驗中，用3種苦參堿制劑處理的斑馬魚均出現游動緩慢和失去平衡的現象；0.5%苦參堿水劑試驗處理組中，斑馬魚還出現了身體彎曲的情況。在溞類急性活動抑制試驗中，3種苦參堿制劑對大型溞均造成游動能力減弱的影響。

2.2 3種苦參堿制劑真實濃度檢測

分別在魚類急性毒性試驗和溞類急性活動抑制試驗開始和結束時采集試驗溶液，并對苦參堿進行真實濃度檢測。在本實驗室條件下，0.6%苦參堿可溶液劑、0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑對魚類急性毒性試驗的濃度偏差的最大值分別為10.00%、15.00%和16.23%，對溞類急性活動抑制試驗的濃度偏差最大值分別為11.17%、6.91%和16.01%。苦參堿實測濃度相對穩定，濃度偏差均保持在理論濃度的±20%，因此使用理論濃度計算毒性端點值[25-26]。3種苦參堿制劑對水生生物急性毒性試驗的暴露濃度見表3。

表3 水生生物急性毒性試驗暴露濃度

2.3 3種苦參堿制劑對供試生物的毒性試驗結果

因受樣品含量和劑型限制，0.6%苦參堿可溶液劑對蜜蜂接觸的毒性試驗、0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑對日本鵪鶉和蜜蜂的毒性試驗均采用最高劑量進行染毒暴露。結果顯示，0.6%苦參堿可溶液劑對蜜蜂接觸的LD50值大于12.1μg a.i./蜂；0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑對日本鵪鶉的LD50值分別大于51.0和12.4 mg a.i./kg·bw，對蜜蜂經口的LD50值分別大于29.2和1.1μg a.i./蜂，對蜜蜂接觸的LD50值分別大于10.2和0.9μg a.i./蜂。由此可見，3種苦參堿達到最高劑量時未對日本鵪鶉和蜜蜂造成明顯的毒害。

除此之外，供試生物的死亡率隨苦參堿濃度的升高而升高，呈現出顯著的濃度/劑量-效應關系。結果顯示，0.6%苦參堿可溶液劑對日本鵪鶉和蜜蜂經口的LD50值分別為42.8 mg a.i./kg·bw和21.1μg a.i./蜂，毒性分別為高毒和低毒。0.6%苦參堿可溶液劑、0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑對家蠶的LC50值分別為44.40、大于2.00×103和3.07 mg a.i./L，毒性分別為中毒、低毒和高毒；對斑馬魚的LC50值分別為1.660、0.213和0.120 mg a.i./L，毒性分別為中毒、高毒和高毒；對大型溞的LC50值分別為3.26、2.47和4.58×10-2mg a.i./L，毒性分別為中毒、中毒和劇毒。3種苦參堿制劑對供試生物的急性毒性試驗結果見表4。

表4 3種苦參堿制劑對供試生物急性毒性試驗結果

3 結論與討論

急性毒性試驗結果表明，0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑對日本鵪鶉和蜜蜂已達到試驗條件下可達到的最高劑量，但未產生明顯的毒性效應。0.6%苦參堿可溶液劑對日本鵪鶉的毒性為高毒，對蜜蜂的毒性為低毒。0.6%苦參堿可溶液劑、0.5%苦參堿水劑和0.3%苦參堿可濕性粉劑對家蠶的毒性分別為中毒、低毒和高毒，對斑馬魚的毒性分別為中毒、高毒和高毒，對大型溞的毒性分別為中毒、中毒和劇毒。由此可見，不同的苦參堿制劑對非靶標生物毒性影響存在差異。

苦參堿原藥對鵪鶉、家蠶、蜜蜂經口和斑馬魚均為低毒，毒性端點值分別為512 mg a.i./kg·bw、大于3 000 mg a.i./L、1 145 mg a.i./L和85 mg a.i./L[14]。本研究所使用的3種苦參堿制劑對非靶標生物的毒性相對苦參堿原藥較高，特別對于斑馬魚和大型溞毒性為中高毒，甚至劇毒。這一結果與川楝素和雷公藤生物堿等植物源農藥的毒性結果較為相似，即78%川楝素原藥對鵪鶉和蝌蚪均為低毒，但0.5%川楝素乳油對鵪鶉中毒，蝌蚪高毒[27]。95%雷公藤總生物堿對蝌蚪為低毒，但1.0%雷公藤生物堿微乳劑對蝌蚪為高毒[28]。同時也有研究表明，部分化學農藥的制劑產品對非靶標生物的毒性高于原藥的毒性，如百菌清和雙甲脒的制劑產品對蜜蜂的經口毒性至少是原藥的4倍[29]；二嗪磷原藥對鵪鶉為高毒，但其乳油和顆粒劑產品對鵪鶉則為劇毒[30]；硝磺草酮不同劑型對斑馬魚的急性毒性順序由大到小依次為：懸浮劑、可分散懸浮劑、水分散粒劑、原藥[31]。Caroline等[32]研究表明，部分農藥助劑具有增強發育神經毒性、遺傳毒性和擾亂激素功能等危害，還可能增強農藥制劑對微生物、植物、魚類和兩棲動物的毒性等。姜錦林等[33]調查發現，常用溶劑甲醇、乙醇、丙酮等在低濃度條件下對水生生物慢性影響較小，但甲苯、二甲苯等對生物存在重大慢性風險，表面活性劑可改變細胞膜通透性，造成細胞內容物外滲，影響細胞的正常代謝活動，最終導致細胞死亡，對水生生物產生不利影響。在101種助劑的毒性調查中，發現4%以上的助劑具有中等毒性，玫瑰精、甲苯、二甲苯、環己酮和壬基酚等具有致癌性、致畸性、致突變性、內分泌干擾性、繁殖損傷和神經毒性等健康風險。因此，苦參堿制劑毒性增高可能與其中添加的農藥助劑有關。

根據NY/T 2882—2016《農藥登記環境風險評估指南》[34]，筆者進行0.6%苦參堿可溶液劑對日本鵪鶉的急性毒性風險評估，得到風險商值最大值為0.074，即該制劑產品對日本鵪鶉的風險可接受。由此可見，農藥對環境非靶標生物的危害不僅取決于農藥對非靶標生物的毒性危害，還與農藥施用后在環境中的暴露濃度有關。盡管不同劑型的毒性差異較大，但鑒于苦參堿易降解，在不同土壤和不同自然水體中的半衰期均不超過15 d[35-36]，在環境中的暴露濃度較低，其風險可接受。

隨著人們對環境保護和生態安全等方面的重視，農藥助劑的安全性也受到了廣泛關注。目前，美國、澳大利亞和歐洲等地區已出臺了關于農藥助劑的管理和登記辦法[37]。我國農藥登記管理中雖暫未明確規定農藥助劑的信息要求，但已開始加強對農藥助劑的管理。因此，在大力開發苦參堿等對環境安全的農藥的同時，研究開發和應用毒性低、對環境友好、可增強藥效的農藥助劑也越來越重要。

綜上所述，雖然苦參堿作為植物源農藥具有對環境友好的特點，但本研究結果表明，苦參堿制劑對部分非靶標生物毒性較高，可能與農藥制劑中添加的助劑有關。因此，在植物源農藥的劑型研制中，建議選用更加高效安全的助劑，以避免對非靶標生物造成危害。