投喂鹽富饒菌Haloferax YC-6強化鹵蟲對凡納濱對蝦 生長和抗逆能力的影響

郭子仙，解 偉，任北妮，段 虎，高美榮，隋麗英

(天津科技大學海洋與環境學院，天津 300457)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是世界養殖產量最高的優良對蝦品種，2019年養殖產量達到496.72萬噸，我國凡納濱對蝦產量達到181.55萬 噸[1–2]．近年來，水產養殖環境惡化和種質退化等問題導致疾病頻繁發生，使凡納濱對蝦養殖產業面臨嚴峻挑戰[3]．對蝦擁有開放循環系統，極易受到養殖水體環境的影響，而環境脅迫造成的應激對對蝦機體抗氧化和免疫系統造成損傷[4]．將功能性添加劑如益生菌、抗菌肽等應用于凡納濱對蝦養殖是提高對蝦免疫力、促進對蝦生長的重要途徑[5-7]．

古菌幾乎能適應地球上所有極端環境，古菌細胞可積累相容性溶質、表層蛋白、類胡蘿卜素等多種生物活性物質[8–9]．鹽富饒菌(Haloferax)是在高鹽環境下生長的古菌屬，具有生長快、耐鹽范圍廣和代謝功能強等特點，因富含菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素等類胡蘿卜素而呈紅色[10]．菌紅素是一種長鏈C50類胡蘿卜素，包含13對共軛雙鍵，且末端含有羥基，是一種有效的自由基清除劑，具有較高的DPPH自由基清除能力，其抗氧化能力高于β–胡蘿卜素[11–13]. 研究表明，類胡蘿卜素能提高水產動物的經濟性狀和品質．富含類胡蘿卜素的飼料能夠促進虹鱒魚(On-corhynchus mykiss)生長，提高色素含量[14]. 向黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)投喂含β–胡蘿卜素的飼料可提高其肝臟中抗氧化酶活性和熱休克蛋白HSP70基因的表達，進而降低由高溫脅迫和病原菌感染造成的死亡率[15]．但古菌及其類胡蘿卜素作為飼料添加劑在水產養殖乃至畜禽養殖中的應用未見報道．

鹵蟲是海水苗種培育重要的生物餌料．作為非選擇性濾食生物，鹵蟲可高效濾食單胞藻、細菌和微小的有機碎屑等．水產育苗中常采用強化方式使鹵蟲腸道包裹攜帶營養強化劑(如魚油)和藥物等，通過投喂強化鹵蟲將其有效送達水產苗種體內．本研究將古菌Haloferax作為添加劑，通過鹵蟲強化的方式將其投喂給凡納濱對蝦仔蝦，從生長性能、腸道菌群組成和抗逆性等方面探討其對凡納濱對蝦的影響．

1 材料與方法

1.1 發酵培養

鹽富饒菌菌株HaloferaxYC-6分離于天津漢沽鹽場結晶池鹵水，將其接種于培養基(7.5g/L酸水解酪蛋白，10g/L酵母提取物，100g/L稀釋鹵水)，150r/min、37℃和光照(2000lx)條件下搖瓶培養至對數生長期獲得種子液．添加5g/L蔗糖于上述培養基中進行發酵培養，發酵體積為3L．發酵條件：pH 5.5～8.5，溫度37℃，初始攪拌速度200r/min，每24h升高100r/min直到400r/min．發酵5d后8000r/min離心10min收集菌體，4℃避光保存．

1.2 鹵蟲強化

將美國大鹽湖鹵蟲卵(比利時INVE公司)在28℃和鹽度30g/L稀釋鹵水中連續充氣孵化，24h后收集鹵蟲無節幼體，轉移至鹽度50g/L稀釋鹵水中，以HaloferaxYC-6菌體強化鹵蟲．鹵蟲密度為200mL-1，菌體投加量(以干質量計)為0.3g/L．強化12h后收集鹵蟲，用相同鹽度的稀釋鹵水沖洗，4℃充氣保存，以維持鹵蟲存活和營養質量．

1.3 實驗動物

實驗所用凡納濱對蝦仔蝦購自河北鑫海生物技術公司．將PL5仔蝦在28℃、鹽度20g/L稀釋鹵水中暫養3d，暫養過程中投喂蝦片飼料．

1.4 實驗設計

選出活力好且大小均勻的蝦苗(平均體長0.53cm)隨機分為2組，分別以饑餓12h鹵蟲和Haloferax菌體強化12h鹵蟲作為對照組和實驗組，投喂凡納濱對蝦．饑餓鹵蟲和Haloferax強化鹵蟲的營養組成(以干質量計)見表1．

表1 饑餓鹵蟲和Haloferax強化鹵蟲的營養組成 Tab. 1 Nutrient composition of starved and Haloferaxenriched Artemia

養殖在循環過濾養殖系統中進行，用海綿過濾食物殘渣和對蝦糞便．養殖箱為長方形聚丙烯箱體(48cm×26cm×39cm)，每組設3個平行，每個平行箱投放蝦苗1000尾，單位養殖水體為20L．養殖期間每天投喂3次，每尾蝦每次的初始投喂量為100個鹵蟲，投喂量按前一天的10%增加．養殖周期為10d，從第6天開始每天換1/3的水．養殖水體鹽度為20g/L，水溫(28±1.0)℃，溶氧量(5.5±0.5)mg/L，pH 7.6±0.2，連續充氣，光/暗周期為16h/8h．

1.5 樣品采集與指標分析

1.5.1 腸道菌群分析

養殖結束后測定對蝦存活率，并從每個平行箱中隨機取10尾蝦測量體長(自對蝦眼柄基部至尾節末端的長度)．從每個平行箱取5尾饑餓24h的對蝦，置于冰上麻醉，無菌條件下解剖取出對蝦腸道，立即放入滅菌的EP管中液氮速凍，置于－80℃保存．將樣品反復凍融后勻漿，采用細菌DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)提取腸道菌群DNA，樣品交予諾禾致源公司使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量檢測文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序．使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1指數、香農指數Shannon、辛普森多樣性指數Simpson、ACE指數和覆蓋率Good-coverage指數．

1.5.2 對蝦粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸測定

將收集的鹵蟲和對蝦進行冷凍干燥(BTP-3ES型冷凍干燥機，美國SP-Scientific公司)．稱取0.05g冷凍干燥樣品，參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定·凱氏定氮法》，利用Kjeltec–8400型全自動凱式定氮儀(丹麥FOOS公司)測定對蝦粗蛋白質含量．稱取0.2g冷凍干燥樣品，參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準·食品中脂肪的測定》，用索氏抽提法測定對蝦粗脂肪含量．稱取0.04g冷凍干燥樣品，準確加入1mg內標液(C20∶2n-6，美國NUCHEK PREP公司)，向混合物中加入5mL甲醇與甲苯混合物(體積比為3∶2)和5mL氯乙酰與甲醇混合物(體積比為1∶20)，充分勻漿(T18型勻漿機，德國IKA公司)后，沸水浴1h．用正己烷萃取脂肪酸甲酯并濃縮[16]，利用GC–2014型氣相色譜儀(日本島津公司)進行脂肪酸定性和定量測定．

1.5.3 弧菌攻毒實驗

副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus MCCC 1A10122)購于海洋微生物菌種保藏管理中心(https:// mccc.org.cn/)．菌種在28℃、150r/min條件下于2216E培養基培養至對數生長期．養殖結束后每缸隨機取出20尾蝦，根據預實驗結果，以弧菌108mL-1劑量浸浴攻毒48h，每隔24h測定對蝦存活率．

1.5.4 氨氮脅迫實驗

每個平行箱中隨機各取出20尾蝦，置于1L含30mg/L氯化銨、鹽度20g/L的水體中．溶液中非離子氨(NH3-N)質量濃度為0.8mg/L[17]．每隔24h測定對蝦存活率．

1.5.5 對蝦肝胰腺抗氧化酶活性

養殖結束后和氨氮脅迫后，在無菌條件下解剖獲得對蝦肝胰腺，用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定其過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量．

1.6 統計分析

數據用“平均值±標準差”表示，用SPSS statistics analysis 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗，*表示有顯著差異(P＜0.05)．

2 結果與分析

2.1 凡納濱對蝦仔蝦存活和生長

投喂Haloferax強化的鹵蟲對凡納濱對蝦仔蝦存活和生長的影響見表2．投喂Haloferax強化鹵蟲的實驗組對蝦的存活率和體長均顯著高于對照組(P＜0.05)．

表2 投喂Haloferax強化的鹵蟲對凡納濱對蝦仔蝦存活和生長的影響 Tab. 2 Effect of Haloferax-enriched Artemiafeeding on the survival and growth of L. vannamei postlarvae

2.2 凡納濱對蝦營養組成

不同組別凡納濱對蝦營養組成見表3．兩組對蝦粗蛋白質和粗脂肪含量均無顯著性差異．實驗組的C14∶1n-5、C18∶0、C18∶1n-9＋n-7和C18∶4含量顯著低于對照組(P＜0.05)，其他脂肪酸含量均無顯著性差異．

表3 不同組別凡納濱對蝦營養組成 Tab. 3 Nutritional composition of L. vannamei in different groups

2.3 凡納濱對蝦腸道菌群多樣性

不同組別凡納濱對蝦腸道微生物α 多樣性見表4．對照組和實驗組的Good-coverage覆蓋率值均為0.99，表明每個文庫的16S rRNA基因代表了對蝦腸道中的大多數細菌．實驗組對蝦腸道微生物多樣性指數均有所上升，但與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)．

表4 不同組別凡納濱對蝦腸道微生物α 多樣性 Tab. 4 Alfa-diversity of intestinal microbiota of L.vannamei postlarvae in different groups

凡納濱對蝦腸道菌群結構門水平變化如圖1(a)所示，對蝦腸道菌群主要以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)為主．與對照組相比，實驗組變形菌門和放線菌門的相對豐度有所下降，厚壁菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度提高．凡納濱對蝦腸道菌群屬水平變化如圖1(b)所示，實驗組弧菌屬(Vibro)比例下降，副球菌屬(Paracoccus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、微小桿菌屬(Acteroides)和乳桿菌屬(Lactobacillus)的相對豐度均有所上升．

圖1 投喂Haloferax強化鹵蟲對凡納濱對蝦腸道菌群門和屬水平的影響 Fig. 1 Effect of Haloferax-enriched Artemiafeeding on the intestinal microbiota of L. vannameipostlarvae in phylum level and in genus level

2.4 凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力

投喂Haloferax強化鹵蟲對對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響結果見表5．與對照組相比，養殖結束后實驗組對蝦肝胰腺SOD活性有所上升，但沒有顯著性差異．實驗組對蝦肝胰腺CAT活性顯著高于對照組(P＜0.05)，MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05)．

表5 投喂Haloferax強化鹵蟲對對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響 Tab. 5 Effect of Haloferax-enriched Artemiafeeding on antioxidative capacity of L. vannamei postlarvae

2.5 凡納濱對蝦抗脅迫能力

2.5.1 氨氮脅迫

氨氮脅迫對凡納濱對蝦存活率的影響如圖2所示．24h 對照組和實驗組對蝦存活率沒有顯著差異，但氨氮脅迫48h后，實驗組存活率顯著高于對照組(P＜0.05)．

圖2 氨氮脅迫對凡納濱對蝦存活率的影響 Fig. 2 Effect of ammonia nitrogen on survival rate of L. vannamei

投喂Haloferax強化的鹵蟲對氨氮脅迫48h后對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響結果見表6．氨氮脅迫48h后，實驗組對蝦肝胰腺SOD活性有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)，CAT活性和MDA含量顯著降低(P＜0.05)．

表6 投喂Haloferax強化鹵蟲對氨氮脅迫48h后對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響 Tab. 6 Effect of Haloferax-enriched Artemia feeding on antioxidative capacity of L.vannamei postlarvae after being exposed to ammonia nitrogen for 48 h

2.5.2 副溶血弧菌攻毒

副溶血弧菌攻毒對凡納濱對蝦存活率的影響如圖3所示．攻毒24h的對照組和實驗組對蝦存活率沒有顯著差異，在91.67%～93.33%之間．攻毒48h后，實驗組對蝦存活率顯著高于對照組(P＜0.05)．

圖3 副溶血弧菌攻毒對凡納濱對蝦存活率的影響 Fig. 3 Effect of challenge with V. parahaemolyticus on survival rate of L. vannamei

3 討 論

3.1 Haloferax對凡納濱對蝦生長和營養組成的影響

本文研究結果表明，投喂Haloferax強化鹵蟲能顯著提高對蝦仔蝦的存活率，促進對蝦生長．有研 究[15,18]表明，飼料中類胡蘿卜素的添加起到促進水產動物生長和提高抗逆能力的作用．Haloferax對對蝦的促進作用可能與細胞膜上大量積累的類胡蘿卜素有關．

本研究中強化鹵蟲的各種脂肪酸含量較饑餓鹵蟲高，與鹵蟲在饑餓狀態下代謝脂肪酸等營養物質為其提供生長存活必需的能量有關．一般而言，n-3多不飽和脂肪酸特別是高不飽和脂肪酸(如EPA、ARA和DHA)對海洋水產動物細胞膜的流動性和滲透性有較大影響[16,19]．對照組對蝦中C14∶1n-5、C18∶0、 C18∶1n-9＋n-7和C18∶4含量顯著高于實驗組，可能與對蝦本身的脂肪酸組成和對餌料中脂肪酸的選擇性代謝有關．

3.2 Haloferax對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

腸道菌群對對蝦維持機體健康和免疫穩態非常重要[20]．本研究中Haloferax的添加在一定程度上增加了對蝦腸道菌群的多樣性，同時Haloferax的攝入降低了變形菌門豐度，主要表現在弧菌屬的豐度降低. 變形菌門廣泛存在于水生無脊椎動物腸道微生物群中，通常是甲殼類動物腸道菌群的主要組成部分[21]. 弧菌是對蝦腸道的優勢菌屬，部分弧菌產生的幾丁質酶有助于其在腸道菌群形成優勢菌，與宿主共存[22]. 但弧菌屬于條件致病菌，其數量和毒力與環境因子有關，環境脅迫造成弧菌的數量和毒力增加，進而致病性增強，導致對蝦的死亡率較高[23-24]．本研究中Haloferax的添加在一定程度上降低了弧菌屬的豐度，提高了乳桿菌屬的豐度，對對蝦腸道健康起到有益作用．

3.3 Haloferax對凡納濱對蝦抗氨氮脅迫能力的影響

古菌細胞膜中含有大量菌紅素等長鏈C50類胡蘿卜素[10]．與β–類胡蘿卜素相比，Haloferax類胡蘿卜素提取物可更有效地清除DPPH自由基，并對H2O2介導的紅細胞溶血具有更好的保護作用[25]．研究[15,26]表明，類胡蘿卜素的添加對水生動物產生積極的效果，改善由養殖密度過高、高溫脅迫或病原菌感染造成的不良影響．在脊椎動物中，類胡蘿卜素發揮了其抗氧化和免疫作用，可以清除過量自由基從而降低自我損傷[27]．類胡蘿卜素也被證實能夠提高甲殼動物免疫力和抗氧化能力[28-29]．

氨氮是影響對蝦存活和生長的重要環境因子. 當暴露于高濃度氨氮時，對蝦機體發生一系列改變，包括肝胰腺損傷、細胞凋亡以及免疫損傷等[30-31]．轉錄組分析[32]表明，氨氮暴露破壞對蝦氧化和抗氧化平衡，造成機體的氧化應激．機體的抗氧化系統包括兩類：酶類(如SOD和CAT等)和小分子非酶類(如谷胱甘肽、類胡蘿卜素和維生素等)．研究[33]表明，對蝦CAT、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶在對蝦氨氮防御中發揮重要作用．本研究發現，養殖過程中Haloferax的添加使對蝦肝胰腺抗氧化酶活力上升，其中CAT活性顯著增加．氨氮脅迫48h后，實驗組對蝦的存活率顯著高于對照組，表明古菌提高了對蝦抵抗氨氮脅迫的能力，與古菌的攝入提高了對蝦抗氧化酶活性進而發揮了氨氮防御功能有關．值得一提的是，氨氮脅迫后實驗組對蝦肝胰腺SOD活性有所下降，CAT活性和MDA含量顯著降低，可能與機體抗氧化系統的反應機理有關．在抗氧化系統中，SOD作為清除活性氧和自由基的第一道防線，能將活性氧轉化為過氧化氫和氧氣，然后過氧化氫通過CAT作用轉化為水和氧氣．MDA是脂質過氧化的終產物，其含量可以作為細胞膜氧化損傷的標志[34]．本研究中氨氮脅迫后實驗組MDA含量顯著降低，表明實驗組對蝦機體氧化損傷程度較輕，而CAT活性降低可能是因為Haloferax提供的類胡蘿卜素代替抗氧化酶發揮了清除活性氧和自由基的功能，進而保護對蝦免受氧化應激損傷．

3.4 Haloferax對凡納濱對蝦抗弧菌能力的影響

副溶血弧菌是對蝦急性肝胰腺壞死綜合征(acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS)的主要病原體．除損傷肝胰腺外，弧菌感染還可損傷對蝦腸道的屏障功能，造成對蝦感染和死亡[35]．本研究中Haloferax的添加提升了凡納濱對蝦對弧菌的抵抗能力，顯著提高了其存活率．其原因一方面可能是Haloferax的攝入降低了對蝦腸道內弧菌屬的豐度，緩解了弧菌感染的程度；另一方面可能與Haloferax含有的活性物質有關．由于對高鹽環境的適應性，嗜鹽古菌產生具有生物活性的初級和次級代謝產物，如酶類、類胡蘿卜素、PHB以及嗜鹽菌素等[9,36-38]，這些物質可能成為對蝦抗弧菌感染的貢獻者．

4 結 論

將古菌Haloferax作為飼料添加劑通過鹵蟲強化方式投喂給凡納濱對蝦仔蝦，可以促進對蝦的存活和生長，改善對蝦腸道菌群，增強對蝦抵抗弧菌和抗氨氮脅迫能力．Haloferax菌體富含大量高抗氧化活性的C50類胡蘿卜素，從而提高對蝦機體抗氧化能力，增強對蝦對弧菌的抵抗力．本研究結果為進一步研究古菌在水產養殖中的應用提供了依據．